GFP基因的克隆和诱导表达
姓名：姜丽萍
学号：2012506003 班级：2012级生技1班
GFP基因的克隆和诱导表达
摘要：以质粒E.coli DH5α为模板，扩增GFP基因，并将其转入大肠杆菌，用IPTG诱导剂诱导GFP基因的表达观察。
前言：绿色荧光蛋白GFP（green fluorescence pro-tein）是1962年Shimomura等从维多利亚多管水母（Aequorea victoria）中分离并纯化得到的一种自发荧光的蛋白．1992年，Prasher等克隆到编码全长GFP的cDNA，但当时人们对GFP的应用前景还不甚了解．1994年，Chalfie等首次在大肠杆菌和秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的GFP，开创了GFP蛋白应用研究的先河．维多利亚水母的GFP蛋白是具有238个氨基酸残基的多肽单体，分子量约为27KD．后来，美籍华人Tsien（钱永健）不仅解析了GFP生色基团发光的原理，而且对GFP进行了大胆的改造，目前实验室使用的发光蛋白，大多都是钱永健改造的变种．2008年，诺贝尔化学奖授予Osamu Shimomura、Martin Chalfie和Roger Tsien三位科学家，以表彰他们因发现和发展了绿色荧光蛋白所做的巨大贡献．GFP作为一种新型的报告基因，近年来得到了广泛的应用，可同步跟踪和判断目的基因在转化细胞中的表达情况．GFP广泛用作分子生物学研究的各个领域，转基因研究中一般将目的基因和GFP基因构建成融合表达载体，转入受体细胞中，通过检测GFP蛋白的表达情况，从而检测基因转化情况。本实验主要是通过构建基因表达载体，将含有目的基因的质粒导入大肠杆菌诱导表达并观察。 关键词：GFP 基因表达载体 诱导表达 正文：
一．材料和方法： 1.实验方法： 1.1碱裂解法：
1.1.1在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种在20mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃、200rmp，摇荡培养过夜；
1.1.2分装菌液到1.5mL离心管中，冰浴2min。4℃、12000rmp离心5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法重复收集一次菌体； 1.1.3将菌体沉淀重悬于100μL冰预冷的碱裂解液I中，旋涡剧烈震荡，混匀。冰浴10min；
1.1.4加200μL新配置的碱裂解液II，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀（切勿震荡），冰浴5min；
1.1.5加150μL冰预冷的碱裂解液III，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解液中分散均匀，冰浴10min。4℃、12000rpm离心15min，移上清液至另一1.5mL新离心管中；
1.1.6加等体积酚：氯仿（1:1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中；
1.1.7加等体积氯仿：异戊醇（24:1），振荡混合有机相和水相，冰浴3min，4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中； 1.1.8加2倍体积冰预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA30min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀；
1.1.9分2次加入1mL冰预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发；
1.1.10加25-50μLTE（内含浓度为50μg/mL的RNAaseA）溶解DNA，37℃
放置30min，消化RNA，保存在-20℃冰箱中。
1.2琼脂糖凝胶电泳：将提取的质粒用溴酚蓝做前沿指示剂，GoldView做核酸染色剂，进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
1.3用限制性核酸内切酶对质粒DNA进行酶切：
1.3.1.构建双酶切体系：Xho IPEGFP 1μL，pET-28a 1μL；Nde IPEGFP 1μL，pET-28a 1μL；质粒：PEGFP 5μL，pET-28a 5μL；10×Buffer：PEGFP 3μL，pET-28a 3μL，用水补足30μL离心10s，混匀。
1.3.2.37℃水浴酶切5-6h。
1.3.3.进行电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。
1.4目的基因的PCR扩增及检测：用PCR的方法对目的基因进行扩增并用琼脂糖凝胶电泳的方法对产物进行检测。PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mM） 1.0μL，上游引物（10μM）1.0μL，下游引物（10μM）1.0μL，质粒DNA（模板）0.5μL，Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）0.3μL，ddH2O 18.7μL，混匀后离心。
PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸40sec；72℃延伸8min，循环次数为30次。
1.5用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的基因进行回收纯化：按琼脂糖凝胶回收试剂盒的使用方法对目的基因的电泳产物进行回收纯化。
1.6用DNA连接酶将目的基因和质粒进行重组质粒的连接：把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：10×T4 DNA ligation Buffer 1.0μL，T4 DNA ligase 1.0μL，PMD-T载体 1.0μL，目的基因产物 5.0μL，ddH2O 2.0μL，总体积为10.0μL，将反应液混匀，4℃过夜。 1.7用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：
1.7.1.将实验室保存的E.coli DH5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20mL无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜；
1.7.2.按照1％接种量，从上述培养液中吸取菌液2mL，转瓶接入200mL新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡继续培养至OD600值为0.3-0.5左右；
1.7.3.在已灭菌的10mL离心管中吸取上述培养液10mL，冰浴10min后，4℃、6000rpm离心10min，收集菌体，弃上清；
1.7.4.加2mL冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重悬菌株，冰浴10min。4℃、6000rpm离心10min，收集菌体，弃上清；
1.7.5.将每一份沉淀轻缓的悬于0.4mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10min；
1.7.6.分装100μL/管（冰浴分装），置于-4℃冰箱保存。 1.8连接产物转化感受态细胞：
1.8.1.先制备LB培养基平板，然后连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞并进行转化涂板。其中，培养基制备：向含100μL/mL氨苄青霉素的固体LB培养基平板上加50mg/mL的IPTG 16μL和20mg/mL的X-gal 40μL，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净，加入IPTG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。
1.8.2.连接产物转化感受态细胞的具体步骤是：
1.8.2.1取5μL连接产物加到100μLE.coli DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min；
1.8.2.2.取出离心管，42℃水浴热激90s，立即置于冰浴中冷却3min； 1.8.2.3.向离心管中加入900μL 37℃预热的无抗生素的LB液体培养基，混匀后，37℃、200rpm振荡培养1h，复苏菌体；
1.8.2.4.取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800μL，用剩余的约100μL上清液将沉淀菌体吸打混匀后，加到含100μg/mL氨苄青霉素的IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌弯头玻璃棒轻轻涂抹均匀，放在室温直至液体吸收。倒置平板，37℃恒温培养14h至16h，直至长出单菌落。再进行转化涂板。
1.8.3.转化涂板：取2个无菌离心管，分别加入100μL DH5α感受态细胞悬液，第1管加5μL无菌水，第2管加入质粒DNA溶液5μL，轻轻摇匀，冰上放置30min；在42℃水浴中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却5min，然后分别向管中加入100μL LB液体培养基，混匀后在37℃振荡培养30min。最后从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上，从管2中取50μL和100μL涂布于含抗生素的平板上，正面向上放置约10分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养。
1.9利用α-互补现象进行重组质粒的PCR鉴定：
1.9.1.先使用无菌枪头随机挑取5个白色菌落，放入含有卡纳抗菌素或氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5mL eppendorf管中，振荡培养4h以上，吸取0.5μL菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。然后进行PCR反应，反应体系如下：2.5μL 10×PCR Buffer（内含Mg2+），0.8μL dNTP（2.5mM），1.0μL上游引物（10μM）、1.0μL下游引物（10μM）、0.5μL菌落DNA（模板）、0.5μL TaqDNA 聚合酶（2.5U/μL）、ddH2O18.7μL。
1.9.2.PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸40sec；72℃延伸8min，循环次数为30次。
1.10利用双酶切法对重组质粒进行酶切鉴定：挑取经菌落PCR鉴定为阳性的菌落，接种在20mL含60μg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜；然后用碱裂解法进行质粒DNA的提取，加50-100μL TE（内含浓度为50μL/mL的RNAaseA）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA；最后用限制性内切核酸酶BamH I和Sal I对PCR阳性菌落提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：
10×Buffer T 3.0μL，Nde I（12U/μL）0.5μL，Xho I（10U/μL）0.5μL，质粒5μL，去离子水补齐至总体积为20μL。然后37℃酶切过夜，60℃灭活酶活。1％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.11用IPTG诱导剂诱导GFP基因的表达：将重组表达质粒转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，同时转化空白质粒作为对照。转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。并观察菌落生长情况，进行菌落PCR扩增鉴定。然后诱导表达：将扩增出目的基因片段的菌落，接种于20mL含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌培养过夜；然后按1:100稀释过夜菌，接种于100mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌继续培养至A600约为0.4-0.8（最好0.6，大约3hr），取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达。每隔1h分别取菌体1mL，离心12000g×30s收获沉淀，观察蛋白表达情况。
