② 滤膜杂交: 用硝酸纤维素制成的滤膜,可以吸附单链DNA或RNA,将变性DNA或RNA吸附到滤膜上再
进行分子杂交,为滤膜杂交.
第四章 DNA的复制
n 半保留复制 DNA在复制过程中碱基之间的氢键断裂，双螺旋解旋并以分开每条单链 DNA分子为模板，产生互补的两条链，新合成出两条与亲代DNA分子完全相同，每个子代DNA分子中的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。
半不连续复制 DNA复制时，因为复制的方向必须是从5’到3’，一条链可以连续复制，而它的反义链复制则是不连续的，会产生冈崎片断，所以称为半不连续复制。
复制子 是指基因组DNA中能够独立复制的单位，含有DNA复制的起始区和终止区的一个DNA复制单位。
复制起点的结构特征
复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，这个复制起点呈现叉子的形式，被称为复制叉。对一个生物体基因组而言，复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。
(E.coli复制起始的最小功能片段长245bp,包含4个9bp的反向重复序列和3个13bp正向重复序列,称为OriC)
·在oriC区域内含有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构,它富含AT。与复制酶系统的识别有关。
·在oriC区域内含有两个转录启动子区，这暗示转录可能在DNA复制时起着重要的作用。 1. oriC 包含4个 9bp 反向重复序列TTATTCACA，和3个富含AT 的13bp重复序列GATCTNTTNTTTT。 4个 9bp 反向重复序列是起始蛋白DnaA的结合位点； DnaA的合成与大肠杆菌的生长率相偶联，所以，复制的起始也与大肠杆菌的生长率相偶联。
2. 30-40 DnaA分子形成复合分子后，使DNA链弯曲，DnaB结合使之解链。 3. oriC 也包含有 11个 GATC. A 被甲基化，则复制起点被活化，复制才能开始。
复制叉 复制开始时，在复制起点处形成的一个特殊的叉形结构，是复制有关的酶和蛋白质组装成的复合体和DNA新链合成的部位，这个部位称为复制叉。
复制的方式(p80) ?型复制 滚环式复制 D-环式复制
DNA复制的酶系
RNA聚合酶 引发酶 解旋酶 解链酶 DNA聚合酶 链接酶…
DNA聚合酶能催化脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA.反应特点:①以4种dNTP作为底物②反应需模板指导③新链的延伸需引物3’-OH存在④链延伸方向5’-3’⑤产物DNA的极性与模板相对.
DNA聚合酶1有哪些活性? 聚合酶活性 3’-5’外切核酸酶活性 5’-3’外切核酸酶活性,不是DNA复制的主要聚合酶.
切除引物、修复
DNA聚合酶II，为多亚基酶,活性比聚合酶I高,无5’-3’外切核酸酶活性,是E.coli主要的修复酶. DNA聚合酶III全酶(10种亚基)，亚基酶, ,无5’-3’外切核酸酶活性,是E.coli主要的复制酶. 由α ε θ构成核心酶,γ 复合体由γ,δ, δ’, χ,ψ五种6个亚基组成，主要作用是―夹子‖装置器 DNA连接酶只能催化多核苷酸链的延长反应,不能使链间头尾链接. E.coli DNA Polymerase I, II, III性质的比较 3’?5’外切 ＋ Ⅰ ＋ Ⅱ ＋ Ⅲ 5’?3’外切 新生链合成 生物学活性 已知结构基因 ＋ － 1 polA － － 0.05 polB － ＋ 15 polC 1、都需要模板指导，以dNTP作为底物，且需要3’－OH的引物链，聚合反应方向为5’ ?3’。 2、都有3’?5’外切活性，起核对作用。 3、Ⅰ有Ⅱ、Ⅲ无5’?3’外切活性。 4、Ⅰ为单一多肽链，Ⅱ、Ⅲ为亚基酶。
4.2细菌DNA复制的机制 4.2.1 大肠杆菌复制的起始
引发体:参与引物合成的蛋白质复合体称为引发体,主要指DnaG和DnaB这两种蛋白.
参与细菌DNA复制的几个蛋白功能:
DnaA蛋白是起始因子1、与负超螺旋DNA结合在OriC处，形成复合物
2、促使OriC中的3个富含AT的13bp重复序列解链，需要ATP和Hu蛋白的促进作用； 3、引导DnaB-DnaC进入局部解链区。
DnaB 的功能有两个1.是解链酶；促进DNA双链的解链；
2.促进DnaG蛋白的结合，活化DnaG，促使其在后随链上合成RNA引物。
DnaC促进DnaB－DnaC复合体的形成，起一个分子伴侣的作用，帮助DnaB 进入复制起始位点的作用。 DnaG蛋白是引起发酶作用的DNA结合蛋白.
回环模型(要点?作用?解释啥的?)
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在复制叉处同一个DNA聚合酶III 负责协同复制前导链和后随链的合成；
DNA聚合酶III全酶是一个二聚体；回环模型能够解释在连续复制和不连续复制的延伸过程中，前导链和后随链之间的复制关系 以及DNA聚合酶的移动和后随链复制的方向的灰机性. 当两条链同时复制时，后随链经过复制叉的部位就形成一个回环，以适应双链同时向前进行这种复制模型称为回环模型。
真核生物DNA聚合酶与原核的对应关系
真核细胞的核染色体复制由 α和δ共同完成. α相当于III中的滑行钳.
ε相当于I, 是修复酶
β也是修复酶 γ线粒体DNA合成酶
4.3.2 真核染色体端粒的复制
△ 端粒酶复制机理:
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白(RNP)复合体,具有逆转录酶活性,能够利用自身的RNA为模板,以反转录的方式,催化与其互补的DNA链的合成. 与细胞的衰老和肿瘤有关. 机制:
1）端粒酶的RNA的3’端AAC与DNA的3’ 端TTG反向互补 结合； 2）端粒酶发挥反转录酶的活性，以其RNA为模板合成DNA； 3）当G足够长时，引发酶合成RNA引物；
4） DNA聚合酶用DNA 为模板以RNA 3’端为引物合成DNA。 5）切除引物在富含G的端粒链上又合成12-16碱基片段。 端粒酶的功能
1. 真核生物通过端粒酶形成端粒（Telomere）结构防止染色体末端缩短； 2. 端粒酶活性与早老症与肿瘤有关；
第七章 RNA转录概述
RNA转录的一般特点:1）转录具有选择性；
2）RNA链的转录起始和终止于DNA上特定的部位； 3）催化反转录的酶是依赖DNA的RNA聚合酶； 4）被转录的DNA双链中有一条参与转录； 5）转录的起始由DNA分子上的启动子控制； 6）合成RNA的底物是ATP,GTP,CTP和UTP； 7）新合成的RNA是以5’→3’方向延伸。
n 单顺反子 大多数真核生物的mRNA为单顺反子结构, 每种mRNA分子只编码一个蛋白质分子的亚基或只编码由单肽链构成的蛋白质分子.
多顺反子 原核生物转录产物为多顺反子.一个mRNA分子含有集中蛋白质的信息,可以编码几种蛋白质. 启动子 是RNA聚合酶识别,结合和启动转录的一段DNA序列. 模板链 用于转录的链称为模板链或负链,又称反义链.
编码链 用于转录的链为模板链,对应的链为非模板链,即正链,又称有义链.因为非模板链与合成的RNA产物链从一个方向阅读时序列完全相同,所以有义链又称编码链.
转录方向一定要清楚RNA聚合酶合成RNA方向5’-3’ 而RNA聚合酶本身是沿着DNA的模板链(反义) 3’-5-滑动 新合成的RNA链总是以5’-3’方向延伸,底物5’-NTP总是加到新生的3’-OH. RNA5’-3’的合成反向与模板DNA方向反平行.
原核与真核基因转录的差异
1）只有一种RNA聚合酶参与原核基因的转录，真核生物有3种以上的RNA聚合酶负责不同类型的基因转录。
2）转录产物差别很大，原核生物初始转录产物大多数都是编码序列,而真核生物的初始转录产物有内含子序列,成熟的mRNA只占初始转录产物的一小部分。
3）真核的转录产物需要经过剪接，加工成熟，而原核转录产物几乎不需要加工。 4）原核转录产物为多顺反子，大多数真核生物的mRNA是单顺反子；
5）在原核生物细胞中，转录产物可以直接作为蛋白质合成的模板，转录mRNA与蛋白质的翻译相互偶联。真核生物细胞的转录是在细胞核进行的成熟后通过核孔进入细胞质在此翻译出蛋白质。
△ P139 启动子结构 原核 核心启动子
启动子上游部位(UP元件)
真核
核心启动子:RNApol能直接识别并结合的启动子
启动子上游部位: 在RNApol结合时需要辅因子协助,这类启动子除了有RNApol结合位点外,还有位于核心
启动子上游的辅助子结合位点,称启动子上游部位.
在原核基因中启动子不被转录, 核心启动子和启动子上游部位(UP原件)两者共同构成原核启动子
细菌启动子的结构: 转录起始点 -10序列 -35序列 在-10序列与-35序列之间较严格的距离
-10 区序列 (DNA解旋的重要部位) ? ? ? ?
–10 区是在–10位左右的6bp的核苷酸序列，被称为； -10 区或（Pribnow box）或TATA Box; 共同的保守序列是 TATAAT; 在大肠杆菌中的其他启动子中，头两个碱基（TA）和最后一个 T 是高度保守的；
这个6个核苷酸的保守序列被6～9（5～ 8）bp从转录起始位点 +1的地方所分开，这个距离对
基因的转录水平是非常重要的；
-35区序列 (识别区域, sigma因子识别的重要部位)
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-35 ~ -10 核心启动子（core promoter） RNApol. 结合位点
-60 ~ -40 启动子上游元件（up element） CAP–cAMP 结合位点
CAP：环化AMP受体蛋白 CAP：降解物激活蛋白
-35区突变，影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但不影响转录起点处的解链。 -10区突变，不影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但影响双链的解链速度。
在 –35位左右处存在一个6bp的保守序列，称为–35区或 Sextama Box； 共同的保守序列是 TTGACA 在大肠杆菌中的其他启动子中，头三个碱基（ TTG ）是高度保守的；
在所有的启动子中，有约 90%是被15～20（16-19）bp 从 –10 区分隔开来；间距为17bp转录效率最高
该区有主要是与RNA聚合酶ζ factor 相互作用，增强识别DNA和相互作用；
