实验五 放线菌、酵母菌和霉菌形态观察
一、实验目的
1．了解放线菌、酵母菌、霉菌的培养方法。
2．掌握放线菌、酵母菌、霉菌的制片技术和染色方法。 3．掌握观察放线菌、酵母菌、霉菌的形态特征的方法。 二、实验原理
1. 放线菌、霉菌和酵母菌在形态特征和生殖方式上有什么异同? 2. 如何鉴别酵母菌细胞的活性?
3. 用乳酸石碳酸棉兰染色液对霉菌制片有哪些优点? 三、实验材料和用具
Streptomyces sp.（链霉菌 ）,Saccharomyces cerevisiae （酿酒酵母 ）， Penicillum citrinum （桔青霉）,Rhizopus oryzae （米根霉），Aspergillus niger(黑曲霉)。
酵母菌染色液：吕氏碱性美蓝染液。 霉菌染色液：乳酸石碳酸棉兰染色液
显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、镊子、酒精等。 四、操作步骤 放线菌制片与观察。
1. 插片法培养放线菌。按无菌操作要求，取链霉菌培养物在高氏一号培养基上密集划线接种。用镊子取无菌载片以45。角插入培养基平板上。将平板倒置，于28℃培养3－5天。
2. 用镊子小心取出用插片法培养的放线菌培养皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦净。然后将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，并绘图。注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。 霉菌的形态观察
1．霉菌培养：按无菌操作方式将霉菌点接于在PDA培养基平板上，于28 ℃培养3－5天。
2. 直接制片观察法：滴一滴乳酸石碳酸棉兰染液于载片上，用镊子取霉菌培养物少许，先于50%乙醇中浸一下先去脱落的孢子，然后将培养物置于染液中，用
大头针小心将菌丝分开。加盖玻片。
3．霉菌观察：先用低倍镜观察菌体的各个部位，认识霉菌各部分结构，必要时用高倍镜观察，尤其注意观察产孢子结构以及根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。绘图并标明各部分名称。 酵母菌的形态观察
酵母菌的话体染色观察及死亡率的测定
1．以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液。
2. 取0.05%美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。
3. 在一个视野里计数死细胞和活细胞，共计数5～6个视野。 酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算： 死亡率=死细胞总数／死活细胞总数×100% 五、注意事项
1．用于活化酵母菌的麦芽汁培养基要新鲜、表面湿润；在产孢培养基上加大移种量，可提高子囊形成率；通过微加热增加酵母的死亡率，易于观察死亡细胞。 2．培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。
3．玻璃纸法培养接种时注意玻璃纸与平板琼脂培养基间不宜有气泡，以免影响其表面放线菌的生长， 六、实验报告
1. 绘出放线菌的形态结构图； 2. 计算酵母菌的死亡率；
3．根霉、曲霉和青霉形态图，示各部结构。 七、问题和思考
1. 试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态的差异？ 2．在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?
实验六 微生物显微计数和大小测量
一、实验目的
1.掌握使用血细胞计数板测定微生物的数量 2巩固显微镜的使用方法。 二、实验原理
1 测量微生物数量的方法有哪些?
2 为什么可用血细胞计数板来测量微生物的数量？
血细胞计数板由四条平行槽构成 3个平台，中间的平台较窄，其中间又被一短槽隔成两半，每边平台面各有一个含 9 个大格的方格网，中间大格为计数室。计数室的长和宽各为l mm，中间平台下陷 0.01 mm，故盖上盖玻片后计数室的总容积为 0.1 mm3。血细胞计数板的构造见图 16. 常见血细胞计数板的计数室有两种规格。一种是 16x 25 型，称为麦氏血细胞计数板．共有 16个小格，每个小格分为 25 个小格。另一种是 25x16 型，称为希里格式血细胞计数板，共有 25 个中格，每个中格又分成 16 个小格。但是不管哪种规格的血细胞计板其计数室的小格均由 400 个小方格组成。应用血细胞计数板在显微镜下直接计算微生物细胞的数量，方法是先测定若干个方格中的微生物细胞，再换算成每 m1 菌液(或每 g 样品)中微生物细胞数量。
图6-1 血细胞计数板
三、实验材料和用具
Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）、生理盐水、美蓝染色液、显微镜、血细胞计数板、擦镜纸、盖玻片、无菌试管、电吹风机。。 三、操作步骤 酵母菌的显微镜计数
1 菌悬液制备：将5 mL的生理盐水加到酿酒酵母的斜面培养物上，用接种环刮取菌苔，将菌悬液倒入盛有5 mL的生理盐水和玻璃珠的三角瓶中，振荡使细胞分散。
2 找计数室和检查血细胞计数板：先在低倍镜下寻找计数板大方格网的位置，转换高倍镜后，调节光亮度至计数室线条清晰为止。在显微镜下检查计数室，若有污物，用自来水冲洗，再用95%酒精棉球轻轻擦洗后，用电吹风机吹干。再将计数室一角的小格移至视野中。顺着大方格线移动计数板，使计数室位于视野中间。
3 加样品：在血细胞计数板上盖上盖玻片，用毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖片边缘滴一小滴，静置5 min，待细菌细胞全部沉降到计数室底部。 4 显微计数：将加有样品的细胞计数板置于载物台上，先用低倍镜观察计数室位置，再换高倍镜进行计数。要求稀释度为每小格内5－10个菌体为宜。计数时，
如用 16x 25 则计数板则按对角线方位，取左上、右上、左下、右下 4 个大格(共4 个大格，100 个小格)内的细胞逐一进行计数；如使用规格为 25×16 型的计数板，则除取左上、右上、左下、右下 4 个大格外，还需加中央的一个大格(共 5 个大格，80 个小格)内的细胞。计数时当遇到大格线上的细菌时，一般只计此大格的上方及右方线上的细胞(或只计下方及左方线上的细胞)，将计得的细胞数填人结果表中．对每个样品重复计数 3 次，取具平均值，按下列公式计算每 mL 菌液中所含的细菌细胞数。
5 清洗: 自来水冲洗，再用95%酒精棉球擦洗，最后吹干放入盒中。 四、注意事项
若计数是病原微生物，则需先浸泡在 5％的石炭酸溶液中进行消毒，然后再进行清洗。 五、实验报告
1．计数板直接镜检计数结果：
六、问题和思考
1． 根据你的体会，血细胞计数板计算的误差主要来自哪些方面?应如何减少误差?
2．设计一个方案：如何计数市售酸奶或三株口服液或菌肥制品的单位含菌数？
