基因工程（跨课程）综合性实验
向改变生物遗传性状的技术。是在体外重新组合DNA分子(脱氧核糖核酸)，并使其在适当的细胞中增殖的遗传操作，这种操作可将特定的基因组合到载体上，并使其在受体细胞中增殖和表达。重组DNA技术基本过程：
a、用人工方法取得或合成目的基因
基因是含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位，基因可被分离出来 。基因的合成主要有化学合成和酶促合成两种方法。
b、运载体的选择
运载体的作用是将分离或合成的基因导入细胞或能转移染色体上的DNA片段，所以它必须能自由出入细胞，常用的运载体有SV40病毒，温和噬菌体和质粒等，但最常用的是质粒。质粒是染色体以外能够自主复制的遗传单元，是由双链DNA分子组成，呈环状结构。它可以游离于细胞浆中，也可与染色体整合在一起，它没有蛋白质外套，是裸露的DNA分子，它比染色体小，只带数个或数10个基因，最大的也只有大约100个基因，它上面有一个位点称为原点，可以携带染色体转移。
c、质粒的分离与重组DNA
用溶菌酶裂解菌细胞分离出质粒。用内切酶处理质粒，使它的DNA在一定位置上断裂，并在断裂口出现粘性末端。用同样的内切酶处理分离出的目的基因的DNA，使之具有相同的粘性末端与质粒粘性末端相连接，形成重组DNA稳定结构。将重组DNA导入不含质粒的细菌，即受体细菌中，例如大肠杆菌(F )中，目的基因能随质粒复制而复制，并随细菌的分裂而扩增，形成这一基因的无性繁殖系一重组DNA克隆化。
2、阳离子脂质体
阳离子脂质体作为基因治疗的载体是目前研究的热点之一，其转染率比pH 敏感脂质体高3～150 倍。选用材料多为二油酰基磷脂酰乙醇胺(DEOP) ，阳离子表面活性剂有溴化十六烷基三甲基铵( CTAB) ，溴化双十二烷基二甲基铵(DDAB12) ，溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB18)，氯化N-(1-(2 ,3-双油酸基) 丙基-N ,N ,N 三甲基铵等。所有的阳离子脂质体都带有一个疏水基团，该基团一般是一至两个脂肪酸或是长约12-18个碳原子的烷基单元或是一个胆固醇单元。疏
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水基团能够保证阳离子脂质体分散在水介质中时形成脂双层结构，从而有效的保护分子中的疏水部分，并将氨基端的基团暴露于水介质中。氨基对于转染能力是绝对必要的，因为它能够通过静电引力与DNA结合并将DNA大分子压缩成可运输的小单元，即形成脂质体复合物。使DNA 分子处于紧缩状态，阳离子脂质体起了中间桥梁的作用，使生物膜表面对DNA 质粒复合物的排斥力降低，有利于DNA分子透过生物膜，提高目的基因的感染率。有很多物理因素如：粒子大小、Zeta电位、DNA/脂质体比例和介质离子强度等都影响脂质复合物的稳定性，复合物的形成和转染效率。
3、质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1 3.1 质粒pCDNA3.1
质粒pCDNA3.1为真核表达载体，具有表达克隆化 cDNA所需的启动子、增强子、加poly(A) 信号等调控元件，及SV40病毒复制子、G418筛选标记基因等序列，是一个高效真核表达载体，为了便于基因操作，多克隆位点有正反两套酶切位点，本实 验采用的是 pCDNA3.1(一)载体。 质粒pCDNA3.1载体的图谱如下：
3.2 T 细胞表面受体(TCR)
肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTL)为肿瘤免疫治疗提供了基础。肿瘤抗原依赖性的T细胞免疫应答通过T细胞表面的抗原受体( TCRs) 与抗原提呈细胞
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(APCs)表面的抗原肽-MHC 复合物相互作用而启动。
T 细胞对抗原肽-MHC 复合物识别是由TCR 的立体结构完成的。TCR 是存在于T 细胞表面的多肽链复合物，分为恒定区(C) 和可变区(V )。人类外周血95%T 细胞表达α/βTCR， 3%～ 5%T 细胞表达γ/δTCR 。近年来发现TCR 中存在ευδ链。α/β的V 区与抗原识别有关，γδευδ链可能与抗原结合和信号传递有关。编码α链的基因由约80 个V 区基因片断、80 个连接区(J ) 片断和一个C 区片断组成; 编码β链的基因由约60 个V 区、2 个D 区(Cβ1,Cβ2)、2 个C 区和13 个J 区(Jβ1. 1～ 1. 6, Jβ2. 1～ 2. 7) 片断组成。以上基因片断在T 细胞发育过程中重排, 产生为数极多的TCR, 以适应不同的T 细胞识别不同的特异性抗原。
特异性抗原刺激T细胞扩增的过程中，T细胞受体β链可变区上的互补决定区(CDR)对抗原识别和T细胞活化发挥着重要的作用。TCR Vβ选择性的T细胞扩增后将释放各类细胞因子抑制肿瘤细胞扩增。
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实验一 质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1的大规模制备
一、实验目的
了解质粒大规模制备基本流程；掌握碱裂解法提取质粒DNA和层析技术纯化质粒DNA的原理与方法；熟悉琼脂糖电泳、紫外吸收等DNA检测与鉴定技术。
二、实验原理
质粒大规模制备在非病毒类载体的重组DNA药物研究开发与生产中占据核心地位。含目的基因的大肠杆菌质粒的提取纯化工艺主要建立于常规碱法制备和柱层析分离纯化手段。对于基因治疗和基因疫苗用临床级质粒DNA的制备而言，去除宿主细胞来源的蛋白、基因组DNA、RNA和内毒素等大分子杂质是主要任务。
在常规碱法制备中，在EDTA存在的条件下，经NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，用有机溶剂沉淀，可获得质粒DNA。
经过碱裂解制备的质粒DNA，还含有大量杂蛋白、内毒素及部分基因组DNA、RNA，在工业规模制备时，一般采用柱层析方法进行分离纯化。离子交换层析纯化质粒主要利用了各种大分子物质的荷电差异。在适当的pH条件下，质粒DNA与大部分杂蛋白都带负电荷，前者所带负电荷一般多于后者，并且质粒DNA电荷数目与基因组DNA、RNA等也存在一定的差异，因此，可利用该性质，通过离子交换层析将其分开。
作为基因治疗或疫苗用途的临床级质粒，还须对质粒的不同构象进行分离，以获得理想的超螺旋质粒DNA，方法以离子交换、分子筛、疏水层析等柱层析方法为主（此处略）。 三、实验试剂
1、 LB培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：
胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g
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