2. 1950s，著名的C. Anfinsen实验的内容和意义是什么？
RNase A（含124个氨基酸，4个二硫键）在8M尿素及β巯基乙醇的作用下变性，不能再水解RNA，但当变性剂除去以后，RNase恢复了原有的构象，能够将RNA水解。
它为氨基酸序列决定蛋白的三级结构提供了第一个证据。 3. 举例说明Covalent modification of proteins的主要类型。
Ser、Thr及Tyr的磷酸化；Lys的甲基化；Lys的乙酰化；Cys的烷基化；Lys的泛素化；Ser及Thr的N-乙酰胺基葡萄糖化（N-acetylglucosamine） 4. 说明Ubiquitin-mediated proteolytic pathway的主要过程。
（1）泛素的活化：泛素Gly端的羧基连接到泛素活化酶E1的巯基，这个步骤需要以ATP作为能量，最终形成一个泛素和E1之间的硫酯键。
（2）E1通过交酯化过程将活化后的泛素交给泛素结合酶E2。
（3）泛素连接酶E3将结合E2的泛素连接到目标蛋白上，当蛋白上已经存在泛素的时候，结合了E2的泛素可以直接连接在其上而不通过E3。
最终，被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。 5. 实验室常用的蛋白质变性剂有哪些？其原理如何？
尿素，盐酸胍：竞争氢键； β-巯基乙醇：还原二硫键
6. 蛋白质分子的三维结构是否完全取决于它的一级结构？ 7. 蛋白质分子是否只能折叠成一种特殊的三维结构？
8. Intrinsically unstructured proteins有哪些特征（结构、功能）？
在中性环境下，表现出高度的可变性并缺乏二级结构单元。亲水性氨基酸含量上升，疏水性氨基酸含量下降，以高的等电点和低的疏水性为特征。
由于它具有高的伸展性，可以跟不同底物结合，并且具有较大的分子界面，易于进行调节。其功能跟信号转导、细胞周期调控及基因表达有关，跟DNA结合与转录、包装、修复和复制有关。
9. 何谓酶蛋白的Km值？如果改变浓度，Vmax和Km值是否改变？
即酶对底物的亲和力，Km值越大，亲和性越小，改变浓度，Km值不变，但Vmax相应改变。
10. 离心法分离纯化蛋白质的原理是什么？
离心主要是根据物质的质量或密度不同，由于蛋白的密度差别较小，主要根据其质量不同进行离心。
11. 在细胞裂解液中，沉降系数最大的组分是什么？密度最大的组分是什么？ 细胞核，RNA。 复习题（3） 1. 名词解释
（1）Free electrophoresis 自由电泳，溶质在自由溶液中的泳动为自由电泳，分辨率较低。 （2）Zone electrophores 区带电泳，带电粒子在固相介质中通过电泳而分离的一种方法，固相支持物有滤纸、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等。
（3）Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳
（4）Sodium Dodecyl Sulfate （SDS）十二烷基硫酸钠，常用于蛋白变性，是一种去垢剂。 （5）SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺为固相支持物的电
泳，其中，SDS使蛋白带有相同的表观电荷，根据蛋白分子量的不同，使蛋白分离。 （6）Isoelectric focusing electrophoresis（IEF） 等电聚焦电泳，利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处，形成一个很窄的区带。
（7）Two-dimensional electrophoresis 双向电泳，是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
（8）Capillary electrophoresis 毛细管电泳，利用毛细管中被分析的带电分子在电场作用下，因移动速率不同而达到分离不同分子的目的。具有高效，快速，微量，高压的优点。 （9）Edman degradation Edman降解法，从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的方法。N末端氨基酸残基被PITC修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。
（10）Mass Spectrometry （MS）质谱，质谱分析是一种测量离子荷质比的分析方法，其基本原理是使各组分发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。
（11）MALDI-TOF MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，适用于混合物及生物大分子的测定。
（12）ESI MS 电喷射电离质谱，对于高分子化合物的测定由于可以产生多电荷峰，与传统的质谱相比扩大了检测的分子质量范围，同时提高了仪器的灵敏度。
（13）Solid-phase peptide synthesis 固相肽合成，将氨基酸C端固定，N端经过保护、去保护，伴随新的氨基酸的添加和肽链延伸的过程，可合成大约50个氨基酸的肽。
（14）Proteome 蛋白组，细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质，包括不同环境、不同状态或不同发育阶段蛋白质水平的变化。
（15）Proteomics 蛋白组学，是研究生物各种基因组在细胞和组织中表达的全部蛋白的分子结构、功能及其相互作用的新学科，旨在发现高疗效、低副作用的新药。
（16）X-ray crystallography X射线晶体衍射，X射线射入晶体，晶体中的电子发生震动成为波源，按照晶格的周期性结构产生布拉格散射，多个电子的散射波相互叠加形成衍射。 （17）Southern blotting Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。首先分离消化的DNA片段，将其变性并在原位将单链DNA片段转移至固相支持物上，固定后用相对应的探针标记，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的位置。 （18）Northern blotting这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，用来衡量真核生物RNA的量和大小，及估测其丰度的一种方法。
2. 第一个完成一级结构分析的蛋白质是什么？是哪位科学家何时、如何完成的？
1953年，Frederick Sanger利用FDNB和纸层析完成了第一个蛋白质分子，牛胰岛素的一级结构分析。
3. 简述分析蛋白质分子一级结构的基本方法（策略）。
使用两种方法将多肽链转移性裂解，逐一测定每个纯化的小肽段的顺序，然后根据这两套肽段氨基酸顺序中的重复区确定小肽段的排列次序，从而完成整条多肽链的顺序分析。 4. 简述用ESI MS/MS进行Protein sequencing的基本过程。
1）蛋白水解后注入一级MS，切割的多肽分离，部分进入后续分析；
2）在二级MS中，肽链被He或Ar轰击，破坏肽键，由于C末端及N末端的不同，产生两种离子化的片段，然后片段的荷质比在二级MS中进行分析，最终在质量分析器中确定其质量。
5. 简述Solid-phase peptide synthesis的基本步骤。
1）通过转脂反应，将第一个氨基酸的羧基共价地连接到固相树脂，α-NH2被t-Boc保护；2）在三氟乙酸的作用下，N末端去保护；3）在DCC作用下，第n个氨基酸与第n-1个氨基酸形成肽键（第n-1个氨基酸被t-Boc保护）；4）重复以上过程，完成的肽链在HF的保护下从树脂上脱落。
6. 研究3D structure of a protein的基本方法有哪些？ X-射线晶体衍射，核磁共振光谱
7. 与X-ray crystallography法测定测定蛋白质三维结构相比，NMR spectroscopy法的两个显著特点是什么？
①可以在溶液中操作；②蛋白的分子量相对较小。 8. 简述Western blotting（immunoblotting）的基本过程。 SDS-PAGE，转膜，一抗孵育，二抗标记，显色。
Chapter 2 Catalytic Strategies
1. 名词解释
1）Transition state 过渡态，在反应过程中，反应能量最高、最不稳定的形式，该状态化学键正在断裂或形成。
2）Activation energy 活化能，过渡态能量与基态能量的差即为活化能。
3）Binding energy 结合能，酶促反应耗能，酶-底物之间通过次级键相互作用，每个次级键的形成均释放少量自由量，这种酶-底物相互作用产生的能量的总和就是结合能。 4）Induced fit 诱导契合，酶-底物结合时，酶蛋白通常表现结构柔性，即结构发生重排，构象发生改变，即为诱导契合。其原因在于功能基团获得必要的空间取向，增强特异的催化能力，形成和稳定过渡态。
5）Nucleophiles 亲核基团，通过贡献电子而与反应物成键的化学基团为亲核基团。 6）Electrophiles 亲电基团，通过得电子而与反应物成键的化学基团为亲电基团。
7）General acid-base catalysis 一般酸碱催化，通过某种反应增加反应基团的亲核性或亲电性的催化反应，最常用的方式是通过质子转移。
8）General acid，General base 一般酸，一般碱，能够释放质子的任何物质为一般酸，能够结合质子的任何物质为一般碱。
9）The catalytic triad 催化三联体，它一般是指特定蛋白酶的活性位点中Ser，Asp，His这三个氨基酸残基，它们一起作用破坏肽链中的肽键。由于酶折叠成复杂的三级结构，酶的催化位点离的较远，但这种三联体的结构使它们彼此靠近。
10）The oxyanion hole 氧负离子穴，氧原子亲核攻击肽键的羰基碳原子，羰基氧原子得负电子形成氧负离子，它与酶肽链骨架的氨酰基团之间产生氢键，形成氧负离子穴，即酶中的口袋结构。
11）Divergent evolution 趋异进化，有些生物或者某些蛋白虽然同出一源，但在进化过程中在不同选择压力的作用下变得很不相同，这种现象称为趋异进化。
12）Convergent evolution 趋同进化，不同的生物或蛋白，甚至在进化上相距甚远的生物或
差异较大的蛋白，在同样选择压的作用下，产生功能相同或十分相似的形态结构，以适应相同的条件，此种现象称为趋同进化。
13）Restriction-Modification systems 限制修饰体系，是细菌或其它原核生物用来防止噬菌体或外源DNA侵入的机制。
14）P-loop P环，是一个ATP结合位点的模体，存在于核苷酸结合蛋白中，是一个柔性环，一般由Gly-X-X-X-X-Gly-Lys组成。 2. 结合能在酶促反应中有什么重要意义？
结合能增加酶-底物相互作用的稳定性，降低活化能和稳定过渡态，并克服了4个热力学障碍：熵减；去溶剂化；底物变形；功能基团空间定位。 3. 酶催化的5种基本机制是什么？
结合能；共价催化；一般酸碱催化；金属离子催化及临近催化。 4. 金属离子在酶促反应中起什么作用？
金属离子通过三方面在酶促反应中起作用：充当亲核电子的催化剂；通过提高临近分子的酸性产生亲核基团（如碳酸酐酶）；与底物结合故此产生结合能（如NMP激酶）。 5. Ser蛋白酶的催化机制是什么？
以糜蛋白酶的催化来说明Ser的催化机制。简言之，糜蛋白酶的催化三联体由Ser195-Asp102-His57组成，是一个酰化与去酰化的过程，伴随四面体的形成和瓦解。
1）酶与底物连接，Ser 195将质子传递给His 57，其氧原子亲核攻击肽键的羰基碳原子，羰基氧原子得负电子形成氧负离子，与酶肽链骨架的酰胺基团之间产生氢键，形成氧负离子穴；
2）以敏感肽键羰基碳原子为中心形成四面体结构；
3）His 57质子化，将质子传递给肽键氮原子，使肽键断裂，形成酰基-酶共价中间体； 4）His 57从水分子吸收质子，产生的OH-立即亲核攻击连接酰基-酶中间产物的羰基碳原子形成短暂的四面体结构；
5）His 57将一个质子还给Ser 195侧链氧原子，释放底物酸性部分，酶恢复原状，准备迎接下一个底物。
6. 几种Ser蛋白酶，如糜蛋白酶、胰蛋白酶及弹性蛋白酶它们识别底物有何异同，为什么？
相同点：3个酶都存在Asp 102-His 57-Ser 195的催化三联体来完成催化，都具有氧负离子穴组成的口袋。1） 3个氨基酸顺序有40%的相同，特别是活性部位Ser 195周围的氨基酸序列相同；2）相似的构象；
不同点：3个酶与底物结合的部位不同：①糜蛋白酶的口袋由非极性氨基酸组成，较宽，结合大的疏水侧链；②胰蛋白酶口袋底部的残基是带负电的Asp 189，可结合带正电的氨基酸；③弹性蛋白的口袋具有Val 126和Thr 226，可防止大侧链的氨基酸进入，只允许小的氨基酸进入“口袋”。
7. 碳酸酐酶使用什么催化机制使CO2的水和反应如此快速进行？
通过His的质子穿梭使酶的活化态迅速再生：His 64从与Zn2+-H2O中夺取一个质子，产生亲核基团OH-和质子化的His；然后Buffer去质子，重新产生非质子化的形式。在其反应过程中，最为关键的是水分子的去质子化。
8. 比较Mg2+在NMP激酶和限制性内切酶活性中心的作用。
在NMP激酶中，Mg2+结合在NTP上，而在限制性内切酶中Mg2+结合在限制性内切酶的活性中心上；在NMP中，NTP与Mg2+结合，形成真正底物，Mg2+使NTP处于合适的构
