中回收含 TALE repeats的DNA fragment；（回收产物可置于-20摄氏度保存）
酶连：将上述回收的两种DNA片段混合，加Solution I (TAKARA) or或者其他合适的DNA
连接酶
转化：将上述酶连后片段转入大肠杆菌体内
1）大肠杆菌感受态细胞的制备（老师提供则不需要此步）
1．从新活化的E.coli菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃振荡培养
过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养3～4h。
2．取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。 3．可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，
冰上放置15～30min。
4．于4℃，5000rpm离心10min。
5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即
制成了感受态细胞悬液。
6．制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入占总体积95％
左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于Ep管中，-70℃条件下可保存半年至一年。 2）细胞转化
编号 样品 对照1 对照2 酶连产物 2 / 2 感受态细胞 100 100 / 无菌水 / 2 / 0.1mol/LCaCl2 / / 100 取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）： 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μL LB液体培养基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。
取各样品培养液100μL分别接种于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB平板培养基
—＋
上（分别记为Amp和Amp），涂匀。37℃培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。
提质粒：
1．取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm离心1min。
2．弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。 3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。
4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。 5．4℃，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。
6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。
7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。
9．用30uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供电泳检验使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。
电泳（检测提取质粒是否成功） 1．琼脂糖凝胶的制备
称取o.21g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL TBE缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为0.7％。 2．胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。
将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左
右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
胶板内的样品小槽
3．加样
用微量加样器将提取的质粒分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker) 4．电泳
加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。 5．染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色30min后，用大量水冲洗。 6．观察
在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。目标质粒大小约为3.1kb。 PCR:
（1）用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。
（2）准备冰盒，开始反应前尽量使PCR管保持在冰上。
（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反应溶液： PCR pre-mix 12.5μL 引物1 1μL 引物2 1μL 提取的质粒 10μL 加无菌水至总体积25uL。 （4）轻弹管壁，混匀溶液。
（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。 （6）按下列程序开始PCR反应： 94℃，1min ? 94℃，15s 68℃，15s
72℃，15 s 30个循环 ? 72℃，10min
?
4℃暂时放置，直至开始电泳
电泳：具体步骤同上，检验片段大小是否符合预期（约400多bp）。 测序：交由测序公司完成
3.2将TALE 重复序列与FokⅠ相连, 构建TALEN终载体并检验（本实验不要求做，了解原理即可）
用SpeⅠ和NheⅠ双酶切“组装好的TALE 重复序列载体pMD-TALE, 电泳后切胶回收备用。回收(n × 102)bp 大小的条带(n 表示pMD-TALE 载体中的TALE 重复单元数), 得到TALE 重复序列片段。将去磷酸化的pCS2 载体骨架与TALE 重复序列片段连接（见下图）、转化, 涂氨苄青霉素平板(Amp 抗性),37℃培养12 h，挑取单克隆菌落, 液体培养基培养,用SP6引物进行菌液PCR，测序验证TALEN序列是否正确。
图6 TALE 重复序列与FokⅠ相连,
