3. 8 紫外灯灭菌
在超净工作台的台面上接种时，每次使用前必须用紫外灯照射，让过滤后的空气吹拂工作台面和四周台壁。在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30 min，将开关关闭。化学消毒剂与紫外线照射结合作用：在无菌室中内，先喷洒3％～5％的石碳酸溶液，再用紫外线灯照射15 min。因紫外线对眼结膜及视神经有损害作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。 3. 9 灼烧法对接种工具的灭菌
接种工具(如接种环、接种镊子、接种针等金属用具)一般分别用牛皮纸包好，经高压蒸气灭菌消毒。放置在无菌的超净工作台的台面上，使用前插入干净的95％的乙醇中。使用时在酒精灯火焰上灼烧，冷却后即刻使用。 3. 10 微孔滤膜过滤除菌方法
微孔滤膜过滤器是由上、下两个分别具有出口和人口连接装置的塑料盖盒组成，出口处连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盒盖之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，达到除菌的目的。此法的最大 优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。 操作步骤为：
(1) 组装、灭菌：将0.22 μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用(0.1 MPa，121.5℃灭菌20 min)。
(2) 压滤：将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤人过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
(3) 无菌检查：无菌操作吸取除菌滤液0.1 mL 于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置温室中培养，检查是否有菌生长。
(4) 清洗：弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经灭菌后使用。
整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染。过滤时应避免各连接处出现渗透现象。
【思考题】
1、植物组织培养的广义与狭义概念？ 2、外植体的含义？
3、根据外植体的不同，植物组织培养可以分为几种？比较常用的是哪些？ 4、植物组织培养有哪些特点？
5、你认为植物组织培养技术在目前的农业生产中有什么价值？为什么？
6、因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些组成部分？各部分的作用是什么？ 7、常规组织培养时，需要什么设备和器械？你是否会用？
8、组织培养中，pH有什么作用？如果pH过高或过低会有什么后果？ AA9、谈谈组织培养中如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度？
5
实验二 培养基（MS）母液的配制
【目的】
使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养基的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。 【原理】
对植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等。不同材料对培养基的要求不同，适当地设计和选用培养基，对植物组织培养取得成功是至关重要的。另外，对组织培养物的脱分化和再分化等状态的调控、次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现。
培养基的主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。 无机营养物包括大量元素和微量元素，大量元素指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、氯和镁，它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶、叶绿素等不可少的元素。微量元素是指铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜等，其需要量很少。培养基中常添加蔗糖作为生长发育的能源和碳源，在工厂化生产中可以用白糖替代蔗糖。植物组织培养中常使用B族维生素，如盐酸硫胺素(维生素B1)和盐酸吡哆素(维生素B6)，它们与各种酶的形成有关。培养基中重要的有机氮源是氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰氨等，它们影响着培养物的生长发育。植物生长物质是培养基中的关键物质，对外植体愈伤组织的诱导和分化起着重要的调节作用。 配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、植物生长物质母液、有机化合物母液。 【实验用品】
1．器具
电子天平、冰箱、pH试纸、烧杯、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、刻度吸管、洗瓶。 2．试剂 硝酸钾（KNO3）、硝酸铵（NH4N03）、硫酸镁（MgS04·7H20）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（CaCl2·2H20）、硫酸锰（Mn04·4H20）、硫酸锌（ZnS04·7H20）、硼酸（H3BO3）、碘化钾（KI）、钼酸钠（NaMo04·2H20）、硫酸铜（CuS04·5H2O）、氯化钴（CoCl2·6H20）、乙二胺四乙酸二钠（ Na2-EDTA）、硫酸亚铁（FeS04·7H20）、甘氮酸、盐酸硫胺素（Vit·B1）、盐酸吡哆素（Vit·B6）、肌醇、2,4-D、6-BA、 1 mol／L盐酸、1 mol／L氢氧化钠。 【实验方法】
1．MS培养基母液配制 1）、大量元素母液配制
(1) 按培养基配方(表2-1)所列大量元素成分(NH4N03、KN03、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O)，取相应的分析纯化学试剂。
(2) 将1 L培养基所需各种大量元素扩大10倍，分别用100 mL烧杯，在电子天平上进行实际称量。
(3) 在盛有1种元素的烧杯中，加入约10mL蒸馏水，放置在磁力搅拌器上充分溶解后转至另一烧杯中。按同样步骤分别溶解各种大量元素后，与第1种大量元素溶液混合。 (4) 混合液倒人1000 mL容量瓶中定容后，转入试剂瓶中，贴上标签(注明配制时间、扩大培数、配制人员姓名)，母液贮存于2～4℃的冰箱中。
6
表1-1 MS培养基(Murashige和Skoog, 1962)母液配制（单位：mg/L） 母液 种类 成分 大量 元素 微量 元素 硝酸钾 KNO3 硝酸铵 NH4N03 硫酸镁 MgS04·7H20 磷酸二氢钾 KH2PO4 氯化钙 CaCl2·2H20 硫酸锰 Mn04·4H20 硫酸锌 ZnS04·4H20 硼酸 H3BO3 碘化钾 KI 钼酸钠 NaMo04·2H20 硫酸铜 CuS04·5H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 6.2 0.83 O.25 0.025 O.025 37.3 27.8 2.O 0.4 O.5 0.5 100 50 100 10 100 19000 16500 3700 1700 4400 2230 860 620 83 25 2.5 2.5 3730 2780 100 5 25 25 5000 1000 20 1000 10 1000 1000 规定用 扩大 称 取 母液定体 配1L MS量（mg/L） 倍数 量（mg） 积/ml 培养基吸取量/ml 100 10 氯化钴 CoCl2·6H20 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 硫酸亚铁 FeS04·7H20 维生素 甘氮酸 （有机盐酸硫胺素 Vit·B1 元素） 盐酸吡哆素 Vit·B6 烟酸 肌醇 注：蔗糖：30 000mg/L培养基；琼脂：10 000mg/L培养基；肌醇在使用时再加入，防止霉变。
表3水稻胚培养基组成
诱导培养基配方 MS+3.5%~4%蔗糖+0.75%琼脂+2mg/L 2-4,D 继代增值培养基配MS +2,4-D 0.5mg /L+NAA 0.2mg/L+1%甘露醇+3%蔗糖+0.75%琼脂 方 *
鳌合铁盐（Fe-Na2.ETDA）的配制：称5.57gFeSO4·7H2O和7.45g 乙二胺四乙酸钠
(Na2-EDTA)，溶于1L蒸馏水中，制成铁盐母液。配制1L培养基，取鳌合铁盐母液5mL. * 按照下面公式，计算需配制培养基的量，然后根据各种母液扩大的倍数，计算从母液中吸取的毫升量。
吸取量(mL)=[需要配制培养基的体积(mL)×需要配制浓度(mg／L)]／母液浓度(mg／L)
2）、微量元素母液配制
按MS培养基配方所列的（Mn04·4H20、ZnS04·7H20、H3BO3、KI、NaMo04·2H20、
7
CuS04·5H2O、CoCl2·6H20）含量扩大100倍进行实际称量，依大量元素母液的步骤，配制母液100 mL，贴上标签，母液贮存于2～4℃的冰箱中。 3）、铁盐母液配制
按MS培养基配方所列FeSO4·7H2O和EDTA-Na2·2H2O含量扩大100倍进行实际称量，依大量元素母液的步骤，配制母液300 mL，贴上标签，母液贮存于2～4℃的冰箱中。 4）、植物生长物质母液配制
在植物组织培养中一般使用水剂植物生长物质，使用方便。本实验配制2,4-D 和6-BA 的母液浓度为1000 mg／L，各配制贮备母液50ml。母液贮存于2～4℃的冰箱中。 (1) 准确称量50 mg生长素类物质2,4-D，先用90％乙醇l～3 mL完全溶解，然后加蒸馏水定容；也可以加入少量碱溶液（如氢氧化钠、氢氧化钾)使其中和成为钠盐或钾解，在蒸馏水中溶解后，再加蒸馏水定容。贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放冰箱保存。一般来说生长素类物质大都可以与培养基一起高温消毒，IAA则需采用过滤灭菌。
(2) 准确称量50 mg 6-BA，加入少量碱溶液(如氢氧化钾、氢氧化钠)或稀盐酸(0.5N)溶液中完全溶解后，加蒸馏水定容到所需要的量，贴上标签，注明名称、浓度和配制日期，放冰箱保存。
注意事项：配制母液必须用重蒸馏水，配制后存放于冰箱中，可保存几个月，当发现母液中出现沉淀或霉团时，则不能继续使用。 【思考题】
1、目前，常用的培养基有哪些？各有什么特点？
2、培养基包括哪些成分？各有什么作用和适宜浓度范围？ 3、请回答MS培养基的基本构成？
4、配制培养基时，为什么要先配母液？如何配制母液？ 5、怎样利用母液配制应用培养基？
6、培养基内加入活性炭的目的是什么？应注意什么问题？
7、实际使用培养基时，为什么通常需加入一定量的植物生长物质？ 8、怎样进行培养基的湿热灭菌？
9、试比较选择培养基时，几种方法的优劣？
8
