植物组织培养实验指导
实验项目、内容提要及实验安排一览表
序号 实验名称 内容提要 实验要求 集中实验时数 1 实验用具的洗涤和灭菌 培常用用具（如玻璃器皿、剪刀、镊子等）的洗涤技术和灭菌方法及注意事项 实验类型 每组人数 必开 6 验证 2 2 3 4 培养基（MS）母液的配制 培养基（MS）的配制及灭菌 配制培养基（MS）的各种母液 必开 6 综合 2 培养基的配制 接种用具及培养基的灭菌 必开 4 4 综合 2 植物外植体消毒和接种 材料的灭菌 接种 必开 4 6 综合 2 5 愈伤组织的诱导 初代培养 观察、统计及拍照记录 必开 6 4 综合 2 6 愈伤组织的继代及分化 培养基的配制、灭菌，接种及继代培养 观察、统计及拍照记录 必开 6 综合 2 4 必开 6 综合 2 7 愈伤组织的生根培养（植株再生） 培养基的配制、灭菌，接种及生根培养 观察、统计及拍照记录 4
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实验一 实验用具的洗涤和灭菌
【目的】
使学生了解植物组织培养中常用的洗涤技术和灭菌方法；掌握培常用用具（如玻璃器皿、剪刀、镊子等）的洗涤技术和灭菌方法及注意事项，为后续实验做准备。 【实验用具】
高压蒸气灭菌锅、实验所需的各种玻璃器皿、金属用品及塑料用品。 【实验方法】 1．洗涤技术 1.1 洗涤液
铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、中、强三种。
弱：用重铬酸钾40g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸90ml。 中：用重铬酸钾40g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。 强：与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫
酸1L加入重铬酸钾40g。 1. 2 洗涤方法
(1) 玻璃器皿洗涤
新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1～2次，干燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是，先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次。用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时左右，再用蒸馏水冲洗1～2次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。 (2) 塑料用品洗涤
塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。
(3) 金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。 2. 灭菌、消毒技术
物理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理；物理除菌 过滤、离心沉淀等。 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌 2.1 培养基灭菌
分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm，灭菌时间与培养基容量的关系见下表。如果使用人工控制的灭菌锅，必须注意灭菌温度的稳定控制，因为温度过高会引起培养基成分和pH的改变，而温度过低则会造成灭菌不彻底。灭菌后的培养基室温下最好在1～2周内用完，特殊情况可贮存于4℃下1个月左右。
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培养基体积与灭菌时间的关系
培养基体积（mL） 20－50 50－500 500－5000
2. 2 玻璃器皿灭菌
灭菌温度（℃） 121 121 125 灭菌时间（min.） 20 25 35 玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时间，一般以25～30分钟为宜。湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖，如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160～180℃后恒温保持40分钟，或120℃灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，灭菌时温度要缓慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎。 2. 3 金属用具灭菌
镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品，使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后使用。也可使用一种小型电热石英砂灭菌器，代替酒精灯，每次使用完后，将用具插入消毒器的中消毒，用时取出冷却。
2.4 接种室灭菌
接种室污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子。因此，每次接种前应进行地面的清洁卫生工作，并用70%酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯照射20min,接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗，使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。 2. 5 外植体灭菌：
(1) 选取生长正常、无病虫危害的组织材料，除去多余部分后将材料整理成适当的大小放入烧杯中。特别不洁的材料则应先行用自来水冲洗。
(2) 用70～75％的乙醇处理材料0.5～1 min.，立即除去乙醇。
(3) 然后在烧杯中加入消毒剂（建议使用次氯酸钠或饱和漂白粉溶液），同时滴1～2滴土温20。，将烧杯置于摇床上振荡10～15min。如果材料污染较严重或组织较老，可适当考虑延长灭菌时间。
(4) 将烧杯置于净化工作台上，弃去消毒液，用无菌水清洗3～4次，每次1min。
(5) 灭菌后的材料可置于垫有无菌纸的培养皿中备用。
需要注意的是，灭菌后的材料应立即接种培养，否则会造成二次感染，同时对于茎、芽、花等组织材料，灭菌后若不立即接种培养，即会影响其生活力而使培养失败。从灭菌处理完成后进入净化工作台操作开始，操作人员必需严格按无菌操作规则完成以后的步骤，否则会造成外植体污染。 消 毒 剂 次氯酸钙 次氯酸钠 新洁尔灭 氯化汞 过氧化氢
几种常用消毒剂的效果比较 使用浓度(％) 消毒时间(分) 10 2～5 10～20 0.1～1 10～12 5～30 5～30 5～30 2～10 5～15 效 果 好 好 好 最好 较好 残液去除难易 易 易 易 最难 最易 3
blance 抗菌素 30 -14～50 mgL 30 30～60 好 较好 易 较难 3. 常用灭菌方法 3. 1干热灭菌法
干热灭菌法是一种常规灭菌法，利用烘箱进行烘烤灭菌，适用于各种玻璃器皿和器械的灭菌消毒。将清洗后的玻璃器皿和器械放入箱内，控制在150℃ 40 min或在120℃ 120 min，即可达到灭菌效果。玻璃器皿在160℃以上的热空气中放置至少2 h。
3. 2 湿热灭菌法
高压灭菌锅通过聚积的潜热与需要灭菌的冷材料接触产生杀菌作用，称为湿热灭菌法，可用于大多数液体(对热敏感的培养基除外)、液体培养基、玻璃器皿、各种器械等的灭菌。一般情况下，培养基灭菌掌握在120℃灭菌20 min；无菌蒸馏水、器械等可在120℃灭菌20～30 min。
3. 3 照射灭菌
用紫外线或电离辐射灭菌适用于接种室空气和台面的消毒灭菌。在实验室中，紫外辐射的灭菌能力有限，电离辐射要用设备产生，在实验室内不便应用。紫外线照射时间一般为15～20 min。
3. 4 过滤灭菌
对于不耐热的溶液(如生长素、赤霉素等)常用细菌过滤灭菌器进行过滤灭菌(见附录)，此法也可用于液体培养基和蒸馏水的灭菌。过滤灭菌所使用滤膜孔径通常为0.2μm或0.45μm，其形状和大小不同。滤器用高压灭菌或干热灭菌，大多数无菌滤膜都是先灭过菌的，因此从包装袋中取出滤膜时注意不要被污染。溶液通过孔径为0.2μm的无菌滤膜过滤到无菌容器中，可以有效除去细菌，但不能除去病毒。 3. 5 熏蒸灭菌
利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。如向甲醛内加入高锰酸钾，促进甲醛的快速挥发而起到熏蒸灭菌的作用。一般1m3用甲醛2 mL，高锰酸钾1g，此法适用于接种室和培养室的灭菌。在消毒前，要注意避免培养物中毒死亡，可以将培养物转移或改用乙二醇熏蒸法的灭菌的方法(1m3用乙二醇6 mL ，其他如前)。
3. 6 灼烧灭菌
在酒精灯火焰上灼烧接种环、接种镊子、接种针等金属用具，以达到灭菌的目的。玻璃棒和涂布器的灭菌也可以利用酒精灯进行火焰灼烧灭菌。
3. 7 湿热灭菌法(手提式高压灭菌锅)对培养基的灭菌
(1) 首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
(2) 放回内层锅，并装入培养基和接种工具，注意不要装得太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，防止冷凝水淋湿包口的纸而透人棉塞。 (3) 加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的2个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
(4) 插上电源，同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气，待冷气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力0.1MPa (121.5℃)时，控制热源，维持压力至所需时间20 min。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。
(5) 达到灭菌所需时间后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
(6) 将取出的灭菌培养基在室温下放置24 h，经检查没有杂菌生长，即可待用。
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