T4DNA连接酶(1U/μl ) 1μl ————————————————————————— 20μl (2)、混匀瞬时离心。 (3)、14℃连接4～16h。
(4)、-20℃保存，直接用于转化。
六、说明
1、此种连接方法是根据载体与目的片段的碱基顺序，使用两种限制酶同时消化载体及切割目的基因，这两种限制酶不产生互补的粘性未端，可防止载体及目的片段的自连，因载体及目的片段是用同种限制酶切割，产生相同的粘性末端(称为相容)，连接效率高并具有方向性，这种不对称相容末端的连接为目的基因克隆的首选。
2、酶活性通常用酶单位表示，本科单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解除1μg λDNA的酶量为一个单位。但是许多实验室制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需要适当增加酶的用量。
3、市售内切酶一般浓度很大，为节约起见，可事先用酶反应缓冲液（1X）进行稀释。酶通常保存在50%的甘油中，实验时，应将反应液中甘油控制在1/10之下。否则酶的洗性将受影响。 4、限制性内切酶的星活性
一般来说,限制性内切存在严格的识别在序列特异性,但某些条件改变,会使其对识别序列特异性的放宽,而导致在DNA内产生附加切割,限制性内切晦表现的这种活性称为星活性,或第二活性,在名称右上角加一星号表示。
产生星活性的条件
①甘油浓度
②离子强度 高盐缓冲液 ③pH值7.5～8.5产生星活性
④有机溶剂DMSO（二甲亚砜）1～2%(V/V)可产生星活性。
2+2+
⑤二价阳离子Mn代替Mg ⑥酶与DNA的比例
酶与DNA 比为(50U/μg)产生星活性。为了防止星活性的出现,所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进衍。 5、影响限制性内切酶反应的因素
限制性内切酶能否有效、特异地切割DNA,最关键的因素有(1)底物DNA的纯度与物理特性A.纯度。酶切反应要求最严的成分是底物DNA,酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反应,有些甚至改变识别序列特性,处理办法为酶切前透析或乙醇沉淀。B.DNA浓度。DNA浓度太稀加量大,含有EDTA影响结果。C.识别序列位点,及与其邻接的特异性。限制性内切酶对DNA序列显示高度特性,因此,识别序列内核苷酸的甲基化或糖苷化都会影响酶切反应,识别位点接近末端的程度也影响切割,如EcoR I要求识别序列后在末端至少有一个碱基存在才能切割。
实验十、重组质粒DNA转化大肠杆菌
一、原理
1、转化的概念
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外源基因DNA片段与载体组成的重组,需先进人受体细胞,才能进行增殖与表达。以质粒为载体得到的重组体或重组子是重组质粒。把重组质粒DNA转入受体细胞(菌)称为转化。把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞(菌)叫转染。
2、感受态
感受态就是细菌吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。所以要转化成功,首先要使受体菌处于感受态。刺激细菌使之成为感受态的方法很多,如CaCl2处理、电激等。 3.DNA转化的过程
受体菌以Ca2+处理,在低温中与外来DNA分子相混合,DNA分子转化的复杂过程包括4步： (1)吸附一完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面;
(2)转化一双链DNA分子解链,单链DNA入受体菌,另一链降解; (3)自稳一外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环装DNA； (4)表达一供体基因随同复制子同时复制并被转录、转译。
二、材料
1、 菌种 大肠杆菌E. coli JM109
2、 质粒pUC18与水稻基因组DNA酶切的连接产物 3、培养基
(1)、LB液体培养基 精解蛋白陈 3g 酵母浸出粉 1.5g 氯化纳 3g 葡萄糖 0.6g
按上述配方用重蒸水(ddH20或dH20表示)溶解至300 ml。用l0mol/L NaOH调pH至7.2~7.4。分装于15ml试管中,每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅灭菌20min。 (1) LB固体培养基
取500ml三烧瓶,加入琼脂4克LB液体培养基200ml灭菌20分钟加入氨苄青霉至终浓度100μg/ml。
三、试剂
1、0.1mol/L CaCl2溶液
2、20mg/ml X-gal：溶于二甲基甲酰胺分装避光保存。
3、200mg/ml IPTG：溶于水0.22μm滤膜过滤除菌分装-20℃贮存。
四、仪器
1、恒温培养箱 2、恒温振荡器 3、离心机
五、方法
(一)、CaCl2法制备感受态细菌
1、将单菌落接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。次日按1%(v/v)的量转入新鲜50ml LB液体培养基中37℃振荡培养至OD600=0.3。
2、将50~100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，4℃下3000g离心10min去上清液。 3、离心管中各加入10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2液重悬菌体，冰浴30min。 4、4℃、3000g离心10min。
5、 去上清液，将管倒置若罔闻分钟以上，使残留的培养液流尽。
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6、 将菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，重悬细胞即为感受态细胞。 7、 于4℃冰箱保存一周内使用，也可立即使用。另一种做法是菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/L CaC12
溶液中，加入300μl无菌甘油或7%DMSO混匀，分装于无菌1.5ml离心管中，用液氮速冻后，置-70℃保存。使用时取出置冰中融化。
(二)、转化反应
1、用无菌吸头取200μl感受态细胞置于预冷的0.5ml离心管中，取水稻基因组DNA与pUC18连管壁几下)，立即置冰上30min。
2、将管放置42℃ PCR仪上热激90s。 3、立即放回冰上15min。
4、加入800μ1无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃培养45~60min。 (三)、重组质粒的抗生索及α-互补筛选
1、 制备含100μg/ml氨苄青霉素的LB的固体平板。
2、 取200μl菌液与4μl IPTG及40μl X-gal (20mg/ml)混匀。
3、 用无菌吸头将混合液移至LB平板上，再用无菌三角头玻棒将菌液均匀涂满整个平板表面。
接的产物加入 60μlTE(pH 8.0)稀释4倍。取10μl稀释连接液到感受态细胞中，轻轻混匀(用手弹
4、 平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿于37℃培养12~16h，挑选白色菌落(含重组质粒)
进行扩增并进一步进行重组子鉴定。
六、说明
1、整个过程均需无菌操作。 2、转化时要设两个对照一个是只有感受态细胞无外源DNA的负对照在筛选培养基上不能生长如有菌落则为污染或抗生素失效。另一个是感受态如胞中加入未进行连接的质粒DNA为正对照。正对照平皿中应有大量的蓝色菌落如果无蓝色菌落出现则表明感受态细胞不好。转化样品平皿中的蓝色菌落是未发生重组的质粒空载体或载体自连体的转化菌。白色菌落为重组子转化菌。 3、 转化DNA溶液与细胞混合后,一定要在冰浴条件下操作。 稀释4倍后按1：20比例与感受态细胞混合进行转化。
4、DNA连接液的盐浓度较高,与细胞混合时要加以稀释,因为高盐浓度会影响转化率。连接产物可用TE
5、 源DNA的大小和结构对转化效率有很大影响,一般说来,分子越小,转化效率越高;环形分子的转化效
率高上千倍,因此,在转化前要尽量保证重组DNA为完整的环形分子。
率比线形分子的转化效率要高等于多。与共价闭环的超螺旋的质粒DNA比同种线形DNA分子的转化效
6、 转化的细菌细胞在对数生长期的转化能力最高,静止生长期以后,转化能力逐渐丧失。
实验十一、 Southern印迹
一、原理
通过Southern（1975）年提出的转移技术进行基因组DNA特定序列定位。用一种或多种限制酶消化基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体（通常是硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。DNA转移到固相支持体的过程中，各DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记或地高辛标记的DNA或RNA固着于滤膜 上的DNA杂交，经放射自显影或染色，可用于检测外源基因在生物体基因组中的整合的情况，鉴定转基因生物。
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二、材料
1、水稻基因组DNA
2、探针来自PCR扩增回收的片段
三、试剂
1、变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
2、中和液：l mol/L Tris·Cl(pH7.4)，1.5mol/L NaCl。 3、转移液(20×SSC)：3mol/L NaCl0.3mol/L拧橡酸纳(pH7.0)。 4、 预杂交液：50%甲酰胺5×Denhardt’s5×SSPE0.1%SDS。 5、 标准杂交液：
5×SSC 50ml 1% 十二烷基肌氨酸钠（N-Lauroylsarcosine(W/V) 2ml 0.2% SDS 0.8ml 阻断试剂（blocking reagent） 20ml
配制方法：甲酰胺50ml50×Denthardt's 10m120×SSPE 25ml10%SDS 1ml加水至dH20总体积100m1。
6、洗膜液I ： 2×SSC，0.1%SDS。 7、洗膜液Ⅱ：0.1×SSC，0.1%SDS。 8、洗涤缓冲液（Washing buffer）：0.1mol/L马来酸，0.15mol/L NaCl,0.3%Tween 20(V/V), pH 7.5 9、1%封闭液（blocking solution）：5g 阻断试剂，用马来酸定容到500ml。 10、检测缓冲液（detection buffer）：0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，50mmol/L MgCl2 (pH9.5)
四、仪器
1、DNA杂交炉 2、烘箱
五、方法
（一）、地高辛法标记探针
采用地高辛标记和检测试剂盒（DIG ＤＮＡ Labeling and Detection Kit）以随机引物标记法标记探针。
１、取回收的ＰＣＲ扩增的质粒ＤＮＡ8μg加水定容至15μl,沸水10min，迅速置冰上。 ２、加入２μl六核苷酸混合物（varc5），２μldＮＴＰ混合物（vrac6），１μl Ｋlenow酶（vrac7），混匀，稍离心，置３７℃反应２小时。 ３、加入２μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)终止反应。
４、加入２.5μl 4mol/L LiCl，混匀，再加入75μl -20℃无水乙醇，充分混匀，置于-20℃沉淀小时。
6、 4℃，12000g离心15分钟，弃乙醇，加入100μl 70%冷乙醇洗涤沉淀，再离心2分钟，弃
乙醇，晾干30分钟。
7、 溶于50μl TE中，-20℃保存。 （二）、水稻基因组DNA的酶切
1、限制酶消化：在0.5ml 1.5ml离心管管中按如下顺序及用量加入试剂建立50μl酶切体系：
无菌ddH20 17μl 10×buffer 5μl
水稻基因组DNA 20μl
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