人的外周血淋巴细胞培养
摘要:本实验多次利用离心机离心以获得白细胞染色体。通过对人外周血液中白细胞中的染色体制备与观察，学会培养基的制备，细胞的悬浮培养和组型分析的方法；使我们懂得了人外周淋巴细胞的组成，掌握离心机使用、低渗处理、染色、采血技术。是研究动物外周淋巴细胞染色体和分析人类染色体的数量、形态、结构的基本技术，在临床医学和遗传学等方面以得到广泛的应用。
关键词：人外周血淋巴细胞；细胞培养；核型；白细胞
引言：
人体1毫升外周血内含有许多小淋巴细胞，通常都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。当在离体培养条件下，加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。供作染色体标本制备和分析用。这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等建立的，近年来已发展了微量全血培养技术，不但取血量少，而且省去分离血浆技术与操作、取材方便，适宜一般的实验室条件下进行。人的外周血淋巴细胞培养以为临场医学，病毒学，药理学，遗传毒理学等方面广泛应用。
1.材料与方法
1.1试验材料：人外周血淋巴细胞
1.2试验用具：注射器、离心管、吸管、试管架、量筒、 培养瓶、酒精灯、烧杯、载玻片、天平、离心机、恒温培养箱、显微镜、普通冰箱。 1.3试剂药品
① RPMI1640培养基，含有20种氨基酸、维生素、生物素、碳水化合物无、机盐 ② 凝血素（PHA）激活细胞分裂 ③ 青霉素、链霉素为广谱抗生素 ④ 促进细胞繁殖和维持pH值 ⑤ 肝素，主要起抗凝血作用
⑥ 秋水仙素，使细胞分裂停止在分裂中期 ⑦ 固定液，使血清蛋白、核蛋白凝抗菌素
⑧ 姬姆萨染液，使染色体染色。
青霉素（以每瓶80万单位为例）：以8毫升生理盐水（或培养基）稀释，则每毫升含10万单位。取1毫升加入100毫升培养集中最终浓度为100单位/毫升。
链霉素（以每瓶100万单位为例）：以2毫升生理盐水（或培养基）稀释，则每毫升含25万单位。取0.4毫升（含10万单位）加入1000毫升培养集中，则每毫升含100单位（即100微克）。（100万单位=1克，1克 =1*1）
2.实验步骤：
2.1培养液的分装：
在无菌室或接种罩内，用移液管将培养液和其它各试剂剂分装入培养瓶，每瓶量为: RPMI1640培养基 4毫升 小牛血清 1毫升 PHA 0.2毫升 肝素 0.05毫升
双抗 培养液中最终浓度各为100单位／毫升
用3.5%调pH到7.2～7.4，分装到20毫升的玻瓶中，用塞子塞紧，待用或置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10分钟。
2.2采血：用2毫升灭菌注射器吸取肝素（500单位／毫升）0.05毫升湿润管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约0.3毫升，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内（内含有生长培养基5毫升）接种，轻轻摇动几次，直立置恒温箱内培养。 2.3培养：置37℃温箱中培养66～72小时. 2.4秋水仙素处理：
培养终止前在培养物中加入浓度为40微克/毫升的秋水仙素0.40～.8微克/毫升，置温箱中处理24～小时。 2.5低渗处理：
低渗液的种类很多，秋水仙素处理完毕后，小心的从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶底，然后加入温浴的低渗液5毫升，用滴管轻轻吹打成细胞悬液装入离心管中置加37℃水浴中低渗处理20分钟使红细胞破碎，白细胞膨胀。 2.6离心：以每分钟1000转离心5分钟，弃去上清液，收集白细胞。
2.7固定：固定液为：甲醇：冰醋酸=3：1.每支离心管中，加入固定液24～毫升，片刻后用滴管轻轻冲打成悬液，在室温中固定15分钟后离心，吸弃上清液，留下白细胞。 2.8再固定：加入固定液2毫升，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15分钟。 2.9在离心：除去上清液，留下白细胞制片。 2.10制片：
向上述离心管中滴入固定液0.5毫升，用滴管小心冲打成悬液。从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液1～3滴，用嘴轻轻吹散，用电吹风吹干，或在酒精灯火焰上微微烤干。
2.11染色：用磷酸缓冲液稀释后的姬姆萨染色液染色20分钟，然后倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗.
2.12镜检：待稍干后，在显微镜下观察，先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后再用高倍油镜观察。
2.13封片：用加拿大树胶封片。选折染色体清晰，分散度好的细胞进行显微摄影，进行核型分析。
3实验结果:
3.1核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。 3.2如图：
3.3数据如下：
编号
绝对长
相对长度 度 短臂 长臂1 2.4 8.45 1.2 1.2 2 2.3 8.1 0.9 1.4 3 2 7.04 1 1 4 1.8 6.34 0.6 1.2 5 1.7 5.99 0.5 1.2 6 1.5 5.28 0.5 1 7 1.4 4.93 0.5 0.9 8 1.3 4.58 0.4 0.9 9 1.2 4.23 0.5 0.7 10
1.2
4.23
0.4
0.8
臂率 着丝粒指数
1 50 1.56 39.13 1 50 2 33.33 2.4 29.41 2 33.33 1.8 35.71 2.25 30.77 1.4 41.67 2
33.33
总长度：28.4㎝ 类型 无 正中着丝粒 无 中间着丝粒 无 正中着丝粒 无 亚中部着丝粒 无 亚中部着丝粒 无 亚中部着丝粒 无 亚中部着丝粒 无 亚中部着丝粒 无 中间着丝粒 无
亚中部着丝粒
随体11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 x y
1.2 1.1 1 0.9 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.6 0.6 0.4 1.2 0.5
4.23 3.87 3.52 3.17 3.17 3.17 2.82 2.82 2.46 2.11 2.11 1.41 4.23 1.76
0.2 0.3 0.2 0.2 0.1 0.35 0.25 0.2 0.3 0.3 0.3 0.15 0.4 0.1
1 0.8 0.8 0.7 0.8 0.55 0.55 0.6 0.4 0.3 0.3 0.3 0.8 0.4
5 2.67 4 3.5 8 1.57 2.2 3 1.33 1 1 3 2 4
16.67 27.27 20 22.22 11.11 38.89 31.25 25 42.86 50 50 25 33.33 20
无 无 无 无 无 有 无 无 无 无 无 无 无 无
亚端部着丝粒 亚中部着丝粒 亚端部着丝粒 亚端部着丝粒 端部着丝粒 中间着丝粒 亚中部着丝粒 亚端部着丝粒 中间着丝粒 正中着丝粒 正中着丝粒 端着丝粒 亚中部着丝粒 亚中部着丝粒
上表数据中包含随体长度
4.讨论与分析
接种的血样愈新鲜愈好,最好是在采血后24小时内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,会影响细胞的活力. 在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要.人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃.培养液的最适pH7.2～7.4. 制片过程中,如发现细胞膨胀得不大,细胞膜没有破裂,染色体聚集一团伸展不开,可将固定时间延长数小时或过夜.
5.参考文献：
［1］ 司徒镇强，吴军正．细胞培养［M］．世界图书出版公司，1996：6269． ［2］王亚馥，戴灼华．遗传学．北京：高等教育出版社，１９９９
