（4）作业提交 学生把老师发下的试卷做完后，通过“作业提交”交给老师。 （二 ）普通光学显微镜
构造 主要由支架部分、机械部分和光学部分组成。
（1）支架部分：①镜座 支持着整个显微镜。②镜臂 是镜筒、载物台、调焦旋钮和聚光器的支持结构。
（2）机械部分：①载物台 又称工作台或镜台，台正中的孔称镜台孔。台上装有标本移动器，其作用是用来固定标本和调节标本的位置。②镜筒 其上端装有目镜，下端连接物镜转换器。③物镜转换器（镜盘）是可旋转的圆盘形结构，其上装有放大不同倍数的物镜镜头。④调焦旋钮安装在镜臂上，有粗调旋钮和细调旋钮两种。旋转前者可大幅度调节物镜与标本之间的距离，而后者只作细微的调节。
（3）光学部分：①反射镜（反光镜） 安装在镜座上，其功能是将光线反射至聚光器。②聚光器 由一组透镜组成，其功能是将来自反光镜的光线聚集到被观察标本上。前两者又称采光部分。其下方的光圈可开大或关小，用以调节光线的强度。③目镜 安装在镜筒头端，装有一个目镜的称单筒型显微镜（单目镜），两个目镜者称双筒型显微镜（双目镜），两目镜可被内外拉动，以调节眼间距，使双眼看到同一视野上。目镜放大倍数有10倍、15倍、20倍，常用10倍。④物镜 安装在镜盘上，放大倍数有4倍、10倍、40倍、100倍等，通常将10倍称作低倍镜，40倍称作高倍镜，100倍称
作油镜。放大倍数为目镜和物镜的乘积。故后两者也称放大部分。 使用方法
正确使用显微镜可提高观察效果和速度，因此，不但要熟悉显微镜构造，更要掌握使用方法。 （1）对光：插上电源插头，打开底座一侧电源开关，将10倍物镜旋至正中；升高聚光镜，打开光圈；眼睛与目镜接触，调节光的强度，光线太强，不但刺激眼睛，而且易损伤灯泡。
（2）放置切片：将切片盖玻片面向上置于显微镜载物台上，操作标本移动器将标本调至中央适当位置。
（3）调焦距：一般用10倍物镜，转动粗调旋钮，至被观察标本与物镜相距约0.5cm处，再缓缓调节两者之间的距离，配合使用细调旋钮，直至图像清晰为止。如换用高倍镜，则在此基础上直接将镜头转至正中，然后操作细调旋钮，便可看到清晰的物象。
（4）标本观察：调好清晰度后，按实验目的要求调节标本移动器，对切片进行仔细观察。 （5）油镜的使用方法：在要观察部位的盖玻片上滴一滴香柏油，旋转物镜转换器，将100倍油镜头旋至正中，然后从侧面观察，使镜头浸入油中。缓缓调节细调旋钮至图像清晰。用完油镜，必须用二甲苯将镜头擦干净。
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（三）注意事项
（1）搬动显微镜时要右手握镜臂，左手托镜座，贴于胸前，以防碰撞。切忌单手提显微镜，万一部件滑脱，造成损伤。
（2）缓慢升降物镜，以免损伤切片。
（3）要用专用擦镜纸擦镜头，不得用手直接擦拭。显微镜经精心调试，并在镜头内安装了指针（在视野内看到的黑线），故不得震动和随便拆卸镜头及其他部件，出现故障或损伤立即报告。用完后包好放回原处。
三、常用制片技术
观察前要了解该标本的制作方式及染色方法。同一标本用不同的染色方法，所呈现的颜色不同，不同的染色方法所显示的结构不同，如硝酸银染色能显示网状纤维、网状组织，而在HE染色的标本上则不能显示。为将结构显示的更好，要根据需要选择染色方法。 （一） 石蜡切片苏木素和伊红（HE）染色法
石蜡切片HE染色法是最基本最常用的制片方法，下面简要介绍制作过程：
1. 取材（obtaining the specimen）：材料一般来自人尸体或手术切除的组织或器官，有的取自动物的组织或器官。最好在2小时以内取材，避免挤压、损伤和污染组织。材料大小一般不超过1.2cm×0.5cm ×0.5cm。
2. 固定（fixation）：固定的目的是避免组织自溶、腐败。固定使组织内的蛋白质变性凝固，使组织易于切片染色。常用固定剂有甲醛溶液、乙醇、重铬酸钾、醋酸与苦味酸等，常用10％甲醛。为提高固定或染色效果，可用复合固定剂。固定液的用量一般要大于组织块体积的20倍以上。材料固定一段时间后硬度增加，修整后继续固定。
3. 脱水（dehydration）及透明（clearing）：固定后的组织含有水分使石蜡难以浸入，所以，浸蜡前需用脱水剂（酒精、甲醇、或丙酮）脱去组织中的水分，常用的方法是用50％、70％、80％、90％、95％、100％酒精梯度脱水。然而，由于酒精和石蜡不能混合，所以，脱水后的组织还需要用能与酒精和石蜡混合的脂溶剂(二甲苯、氯仿、甲苯等)浸透，取代组织中的酒精，从而使石蜡易于浸入组织。脂溶剂浸透后的组织折光率增加，变得较为透明，故称为透明。
4. 浸蜡：将透明的组织块投入溶点为，54℃～56℃，56℃～58℃，58℃～60℃溶蜡中，使蜡浸入组织细胞内。
5. 包埋（embedding）：组织块经上述处理后，置于盛有溶蜡的包埋盒中，待冷却。 6. 切片（sectioning）及贴片（mounted）：切片前将蜡块修成需要的形状，将其固定于切片机上，切成5～10μm厚的薄片。将切好的（组织片）蜡片在温水中展开贴于清洁并涂有薄层蛋白甘油
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的载玻片上。置37℃恒温箱内烘干。
7. 染色（stain）：染色前入二甲苯脱蜡，再依次入100％、95％、90％、80％、70％、50％酒精至水，然后入苏木素（hematoxylin，紫蓝色碱性染料）染细胞核，用水洗去玻片上多余染液，再用盐酸酒精分色，自来水冲洗兰化，目的是使细胞核着色适度，背景清晰。经水洗后入伊红（eosin，红色酸性染料）染细胞质。
9. 脱水、透明：经70％、80％、90％、95％、100％酒精脱水。再经二甲苯透明，以增加组织透光度，提高观察效果。
10. 胶封：在透明后的标本上滴一滴树胶盖上盖玻片，凉干或烘干后可长期保存。 （二） 普通组织化学技术——PAS反应
PAS反应是较常用的一种组织化学技术。其前期制片过程从取材到脱蜡复水与石蜡切片HE染色法基本相同。浸水后的切片作如下处理：过碘酸氧化→水洗→希夫试剂→水洗→苏木素（染核）→脱水透明→胶封。此方法可用来显示基膜、糖原、粘液性腺细胞内的粘原颗粒等。 （三） 免疫组织化学技术
将普通组织学技术和免疫组织化学技术有机的结合在一起，切片的前期和后期处理基本同普通组织学技术，但各步骤要求比较严格。不同之处主要是染色所用试剂为免疫组织化学试剂。 (四) 电镜技术
制备超薄切片程序和石蜡切片相仿，但要求极严格。主要区别是：取材很小（1mm），所用固定液为戊二醛和锇酸，脱水后用树脂包埋，用超薄切片机切片，切片用醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，透射电镜观察。如要观察标本的表面立体构像，则组织块不需切片，用上两种固定液固定后再经脱水、干燥、表面喷碳和金属膜后扫描电镜观察。 （五）细胞培养技术
从机体分离和纯化组织中某种细胞在体外适宜的营养、温度、pH值、O2、CO2浓度及无菌条件下进行培养，使细胞生长繁殖，成为细胞培养。培养的活细胞需用相差显微镜观察。
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四、实验步骤和方法
组织学实验主要是用显微数码互动系统观察组织切片，注意显微镜焦距和电脑显示屏图像清晰度可能不一致，也就是说从目镜观察图像已清楚，电脑图像不清晰，反之亦然，要注意调试；也可配合观察图谱、电子图谱，电镜照片、模型等。观察切片过程中应注意以下几点：
1.观察步骤：先用肉眼观察，再用低倍镜，最后用高倍镜观察。必要时用油镜观察。 (1) 肉眼：观察组织的外形、断面、颜色等。
(2) 低倍镜：了解组织切片的全貌，确定结构类型，若是中空性器官应从内（腔面）向外逐层
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观察。注意各层的结构特点及层与层之间的关系。如果是实质性器官，应从外周（一般为被膜）至中心依次观察，重点观察实质的结构。
(3) 高倍镜：在低倍镜观察的基础上，进一步观察组织和细胞的微细结构包括细胞的形态，细胞间的相互关系及细胞间质的结构特点等。
(4) 观察切片过程中要开动脑筋，不但注意要求看什么，更要关注看到的是什么。要运用比较的方法，辨别不同组织结构的异同，以利于加深和巩固对其特点的认识。
（5）对你感兴趣的图片进行拍照、存储。 2. 注意事项：
(1) 实验用所有切片多为石蜡切片苏木素和伊红（HE）染色标本。
(2) 应重视低倍镜下结构的观察。切勿因盲目追求放大倍数而直接用高倍镜观察。高倍镜虽然放大倍数大，但视野较小容易忽略全貌，以致观察结果不全面、不准确、甚至错误。
(3) 取材和切片制作过程中，要经过复杂的技术处理，不可避免地对组织产生损伤，造成人工假象。如出血、上皮细胞脱落、组织间出现裂隙、皱褶、刀痕、染料残渣等，应注意区别。
(4) 注意平面和立体的关系，由于切片的部位和方向的不同，同一组织或器官可呈现不同的图像。
4绘图：绘图可以加强学生对于组织结构的理解和记忆，同时也是培养观察和综合分析能力的一个重要环节。绘图应在仔细观察并理解的基础上，选取典型部位绘制。图应力求反映镜下所见的真实结构。颜色应尽量与标本颜色相对应，如在HE染色的标本上，细胞质着红色，细胞核着蓝色。图面设计、大小比例、颜色深浅、线条粗细要合理，注字时要求拉线平直、字头对齐、书写端正（提倡用英文注字）。
五、思考题
1. 石蜡切片HE染色标本的制作主要经过哪些过程？
2. 解释名词：（1）HE stain (2) Acidophilia (3) Basophilia (4) PAS reaction
（ 苏衍萍）
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