综述
DNA损伤检查点控制的细胞周期综合调控网络和双链断裂修复
佩特拉Langerak和保罗·罗素*
分子生物学系，斯克里普斯研究所，北多利松10550号， 拉霍亚，CA 92037，USA
由于接触到外源染色体断裂剂或作为内源性细胞代谢的一种副产品而产生的双链断裂（DSBs），可对基因组的完整性造成严重威胁。作为癌症的一个标志，双链断裂可以割断整个染色体，导致染色体不稳定。医治损坏的DNA需要时间，因此，DSB修复进行时会暂时停止细胞分裂。有关细胞周期蛋白依赖性激酶作为细胞周期控制调节器的开创性发现发动了一系列的研究，旨在确定DNA损伤如何反应细胞分裂网络延迟。这些努力终止于Cdc25的确认，它是一种蛋白磷酸酶可激活Cdc2/Cdk1，作为检查点激酶Chk1的一个关键性的目标。然而，调控工作左右逢源，最近的研究表明，Cdc2的活性和细胞周期的状态决定双链断裂是否由非同源染色体末端连接物修复或同源重组（HR）。本调节的核心是蛋白质，MRE11-Rad50－NBS1蛋白质复合物和Ctp1/Sae2/CtIP，以及检查点激酶Tel1/ATM和Rad3/ATR，启动于DNA加工处理终止于HR修复。在这里，我们回顾最近的调查结果，并深入剖析蛋白质如何调节细胞周期进程影响DSB修复，以及反过来修复双链断裂的蛋白质如何影响细胞周期进程。
关键词：MRN复合物; Cdc2;非同源染色体内连接物;同源染色体重组;共济失调毛细血管扩张症突变;共济失调毛细血管扩张症和Rad－3相关的。
1．引言
基因组的保存对所有生物体生存和健康是至关重要的。由于基因组是经常处于外源DNA损伤剂，如紫外线或自然辐射，与内源性DNA损伤剂，如所有生物体的细胞氧化代谢产生游离自由基，基因组配备有多种途径，辨认和修复DNA损伤。DNA损伤最有害的形式之一是双链断裂（DSB）。DSB 可因暴露电离辐射直接诱发，或间接通过DNA的化学修饰，导致活跃的周期循环的细胞复制叉停滞和崩溃。此外，双链断裂是故意产生在减数分裂细胞和淋巴细胞中的V（D）J重组和种类转换重组[1]。当剩下的失修时，双链断裂可能导致过多的染色体畸变，往往导致引起癌症表型的细胞死亡或突变[2]。 修复DNA双链断裂的有两个主要途径：非同源内连接（NHEJ）和同源染色体重组（HR）。NHEJ关键蛋白是从酵母到人类保存的，包括用高亲和力捆绑DNA末端的Ku70-Ku80异源二聚体， 以及XRCC4样因子（XLF）/ Cernunnos的和DNA连接酶IV [3,4]。在NHEJ过程中，DNA末端是被Ku70－Ku80辫认，捕获和聚合的。在Ku异源二聚体补养核酸酶（带有DNA依赖蛋白激酶催化亚基的ARTEMIS，DNA-PKcs），聚合酶（?和?）和连接酶复合体（带有DNA连接酶IV的XLF）。经过由核酸和聚合酶几乎没有结束的处理，末端被直接连接[5]。虽然NHEJ是高效，它不确切的性质，使得它容易产生突变。 NHEJ在整个细胞周期都很活跃，但是首选在修复G0，G1期和早期S期[5]。另一方面，HR，一般只限于细胞周期S期晚期和G2期，因为它在有丝分裂细胞合成依赖性修复中通常用完整的姐妹染色单体作为模板[6,7]。当Mre11-Rad50-Nbs1/Xrs2（MRN）复合物辨认并捆绑DNA 末端时，HR-或同源定向修复（HDR）启动。DSB每一面的DNA末端都经过5至3的切除.复制蛋白A（RPA）合成物结合所产生的3单链DNA（ssDNA）悬突。在酵母中，RAD52催化ssDNA上Rad51群落，从而取代RPA[8-10]。 Rad51覆盖的纤丝启动同源性搜索和催化链交换以使DNA复制启动以修复DSB[11,12]。HR被认为是一个无错误的途径，因为它主要使用姐妹染色单体的同源序列作为修复的模板。有趣的是，在脊椎动物细胞中的DNA双链断裂主要由NHEJ修复而不是HR。虽然一直推测染色体浓缩可能使同源性检索非常困难，从而导致优先用NHEJ为DSB修复[13]，染色体浓缩并不是相间染色质的特征。相反，相间染色质被组蛋白包裹，它一直被认为是通过成功识别和捕获同源
'''性的障碍，通过入侵的Rad51覆盖的纤丝进行阻碍。然而在过去5年中进行的一些研究显示不管是在体外和体内实验周围的组蛋白包裹DNA并不是通过HR干扰。
有趣的是，在减数分裂中同源染色体之间重HR是必不可少的，它对于染色体适当分离和遗传差异的产生都是不可少的。许多人类疾病被探测到NHEJ和HR缺损，包括神经系统的症状，以及免疫和发育障碍，放射敏感性，早老症和癌症，强调在维持基因组稳定性中NHEJ和HR的重要性[17-22]。
在G1期优先选择NHEJ和S期优先选择HR暗示在细胞周期中DSB修复的模式是有规律的。同时，细胞周期检查点发挥了延缓有丝分裂起始的关键作用，直到DSB修复完成后，否则远端的染色体断裂片段将会在细胞核分裂期丢失。在这里，我们描述了最近的调查结果，并提供有关蛋白质如何调节细胞周期进程以影响DSB修复，反之，DNA双链断裂修复蛋白怎样影响细胞周期进程的见解。
2．调节细胞周期进程
在20世纪50年代初，第一个公布的实验证据显示，植物和动物细胞在细胞分裂的特定时期内合成DNA[23-26]。这导致细胞分裂分成四个不同的阶段：核分裂相或M，第一分裂间期或G1，DNA合成期或S和第二分裂间期或G2。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的发现提供了第一个有关如何有规律的从DNA复制起始和进入有丝分裂的转换的线索。裂殖酵母中Cdc2的确认，激活Cdc2/Cdk1的磷酸酶，推动了对细胞周期调控的认识进一步向前发展[27]。CDK是绑定在细胞周期蛋白上的丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白以产生有活性的异源二聚体。然而CDK细胞周期调节蛋白复合物，在通过Wee1和Myt1抑制磷酸化的过程中处于非活动状态[28]。在激活激酶结构域的环路实现细胞周期蛋白CDK复合物的完全活性时Cdc25去磷酸化变为Cdc2/Cdk1 [28]。在裂殖酵母和酿酒酵母中的一个单一的CDK，Cdc2和Cdc28，可分别触发的 G1到S和G2到M的转变。虽然许多CDKs存在于哺乳动物细胞中，似乎Cdc2的同系物Cdk1是有丝分裂起始所必需的，可以与所有细胞周期蛋白互相干扰，可以单独推进培养中的哺乳动物细胞的基本周期[29]。缺乏Cdk1导致小鼠胚胎致死率说明异常的CDKs补偿Cdk1的能力是不完善的[29]。反向也是如此，三重Cdk2 Cdk4 Cdk6突变体缺乏所有相间CDKs出现胚胎致死现象[29]。
3．DNA损伤后如何停止细胞周期
细胞一直处在DNA损伤剂的攻击之下，被细胞分裂时遗传信息的忠实传递所干涉。因为修复破损或损坏的DNA需要时间，循环周期的进程必须可以暂时停顿。在20世纪80年代末，确定存在DNA损伤时监督机制能够延缓细胞周期[30-32]。这些机制现在简称为检查点。哺乳动物细胞有三个主要的DNA修复检查点：G1 / S期，S内部和G2 / M [33]，而裂殖酵母似乎只有两个：S内部和G2 / M期检查点。在检查点的简化模型中，四组蛋白质可以被识别：损坏传感器，信号监督，信号转导和效应器。在DNA双链断裂的情况下，似乎MRN复合物作为主要传感器，因为它可以识别和定位细胞周期各个阶段的DSB[34,35]。MRN可随后通过与Nbs1亚基的结合添补共济失调毛细血管扩张症突变（ATM，或酵母中的Tel1）检查点激酶 [36-38]。ATM所属的3磷酸腺苷激酶相关蛋白激酶（PIKK）激酶家族并通过磷酸化下游的目标激活检查点信号。尽管事实上，MRN复合物在所有物种的ATM招募中都是必须的，但在DNA双链断裂时ATM的功能是不固定的。在酵母中，DSB修复不需要ATM，但主要是参与端粒检修[39]。两个PIKK激酶家族的其他成员在检查点通信中起作用，是ATM-和Rad3相关（ATR，或裂殖酵母中的Rad3）以及DNA-PKcs。 Rad3被招募到损伤位置，通过结合它的相互作用的配偶体Rad26 /ATRIP（ATR-相互作用蛋白）到覆盖有RPA的单链DNA [40]。在酵母中，是Rad3而非Tel1负责DSB探查的DNA损伤通信 [41,42]。另一方面，酵母中没有确定的同系物，DNA-PKcs，与Ku异源二聚体交互作用，后者是另一个DNA损伤传感器，识别并结合DNA双链断裂[43,44]。 ATM，ATR和DNA-PKcs的活化取决于他们通过发现在Nbs1 ,ATRIP和Ku80上的保守序列的介导召集到损伤位置 [37]。
PIKK激酶作为损伤信号传感器，最终磷酸化并激活下游的效应激酶：检查点激酶1和2（Chk1和裂殖酵母中得Cds1）。从传感器到效应激酶间的信号传递是被介质蛋白质促进和增强的[45,46]。在裂殖酵母中，Chk1活化的关键介质是Crb2，Crb2缺陷细胞无法激活G2/M检查点的[47,48]。两种类
型的组蛋白修饰确保Crb2集中到损伤的位置：在Crb2上的一个串联BRCA1羧基末端（BRCT）区域绑定到羧基末端的磷酸化组蛋白H2A（g-H2A）[49,50]，而串联都铎式区域绑定到组蛋白H4上的二甲基赖氨酸20（H4-K20me2）[51,52]。大部分介质蛋白召集到DSB并不严格依赖于g-H2A/H2AX，因为他们与集中在双链断裂上的蛋白质有额外的相互作用，而大规模的长期存在于断裂处的蛋白质需要结合?-H2A/H2AX[53]。有趣的是，传感器激酶ATM，ATR和DNA-PK（包括DNA-PKcs和Ku异源二聚体）负责H2A/H2AX的磷酸化[49,54,55]。Chk1的Rad3依赖性激活所需的第二个因素是一种蛋白质复合体包括Rad9-Rad1-Hus1（9-1-1-复合物或DNA损伤检查点夹）[56-59]。有趣的是，DNA损伤上填装的蛋白质复合体是通过与RPA覆盖的单链DNA的相互作用来增强的，类似Rad3-Rad26 [60,61]。
现实的细胞周期阻滞是被效应器激酶Chk1和Cds1强制造成的。在裂殖酵母中，Chk1的是在G2期激活，而Cds1是在S期为了响应复制叉停滞而激活的[33]。在裂殖酵母的研究已经确定为Cdc25是Chk1和Cds1的关键目标[62]。用Chk1和Cds1磷酸化有活性的Cdc25证明能够抑制Cdc25的活性[63]。缺乏Cdc25，Cdc2的抑制磷酸化不会被去除，细胞周期也会停止。裂殖酵母中的RPA，PIKK和检查点激酶，Cdc25和Cdc2间的相互作用如图1所示。
4。 KU和MRE11-RAD50-NBS1蛋白：不仅仅是发信号
第一个探测或辨认出双链断裂的蛋白质复合体是Ku异源二聚体和MRN复合物。除了起始DNA损伤检查点的激活，这些蛋白质复合物的分别被NHEJ和HR修复实际双链断裂所需要。如前所述，Ku召集哺乳动物细胞中的DNA-PKcs形成DNA-PK，并启动检查点发信号。此外，Ku召集连接两端的XRCC4/DNA连接酶IV复合物[64-67]。这一步被XLF/Cernunnos所促进[68,69]。所有物种NHEJ修复DSB均需要Ku和DNA连接酶IV的同系物以及XLF [5,70-73]，提示激活NHEJ修复模式的高度保护。有趣的是，DNA-PKcs不仅激活检查点发信号，但也被认为将两个DSB的DNA末端带到临近的闭合末端的桥接因素[74]。酵母细胞缺乏DNA-PKcs，这表明DNA的末端桥接功能是由另外的蛋白质执行的。Mre11-Rad50-Xrs2（MRX）复合物可能在芽殖酵母中执行此功能[75]。奇怪的是，裂殖酵母中的NHEJ是不需要MRN的[71]，为NHEJ留下把DNA末端连一起的打开桥接的因素。
双链断裂的HDR的首要基本步骤是DNA末端的5至3切除。目前的模型，主要是基于对酿酒酵母进行的研究，提示切除是一个两步的过程，可以分为切除启动和切除扩展。第一步需要MRN复合物：切除启动[76,77]。虽然Mre11在体外有单链DNA内切酶和3至5双链DNA外切酶的活动[78]，这些活动在芽殖酵母切除中并不是真正需要的，除非扩大切除需要的外切酶1（Exo1）和Sgs1-Dna2蛋白质缺乏（见下文; [79 -81]）。芽殖酵母中的Mre11核酸突变体对如?-辐射和甲基诺瓦经等的DNA损伤剂适度敏感，然而在裂变酵母的同功核酸酶缺失突变体对相同的DNA损伤剂是高度敏感的[82-84]，虽然它们在其它物种中没有和Mre11无效突变株一样敏感。这是在对比在小鼠胚胎成纤维细胞进行的一项研究(MEFs），这表明Mre11核酸酶突变体表型模拟Mre11不足[85]。虽然对裂殖酵母Mre11核酸酶突变株的研究揭示了Mre11核酸酶活性在DNA末端的蛋白共价联合加工过程中的作用的 [86 -88]，?-射线辐照引起的双链断裂修复中的Mre11核酸酶活性的功能仍是一个谜。 切除的启动，还涉及了芽殖酵母中的Sae2蛋白 [76,77]。然而， Mre11核酸酶活性中寻找突变体缺陷，切除和DSBSae2?突变体缺陷与mrx?突变体比较是适度的，缺乏MRX复合物的亚基之一[80]。当延长切除术需要的Exo1和Sgs1依赖性活性被取消时，Sae2d对切除的贡献变得清晰。Sae2被证明在体外有核酸酶的功能，支持其在切除术中的作用[89]。裂殖酵母属Ctp1和哺乳动物CtBP干扰蛋白（CtIP）共享序列类似于Sae2并被推定是Sae2同源，虽然并不知道它们是否共享Sae2检测的核酸酶活性。与对大多数DNA损伤剂只有微弱敏感性的Sae2?突变体相比，裂殖酵母cpt1?细胞对DNA损伤剂是真正地敏感，表明表型模拟等价于mrn?突变株[90-92]。这些物种对Sae2与Ctp1的需求量不同的原因未知，但它们提示了Ctp1可能在另外的野生型背景下地切除术中起关键作用。染色
''''质免疫沉淀（ChIP）的研究显示，RPA局限化位点专一的DSB在cpt1?细胞中强烈减弱可支持这种预测[90]。定量测量裂殖酵母体内DNA末端切除以确定Ctp1和切除术中MRN缺失的影响会很有趣。有趣的是，哺乳动物细胞中RNA干扰实验结果表明，当CtIP被击倒时RPA灶结构缩小[93]，这表明有效的切除可能需要CtIP。从这些研究中，似乎都Ctp1/CtIP可能对于裂殖酵母和哺乳动物DNA双链断裂的加工起关键作用，反而Sae2在芽殖酵母中的不太关键，或许因为替代性活动可以更有效地替代为Sae2。奇怪的是，Ctp1和CtIP通过与MRN复合物的Nbs1蛋白亚基的相互作用添补到DSB[90,93]，而Sae2不需要MRX蛋白复合物以集中到DNA双链断裂[34]。在DNA双链断裂的上固定的CtIP也需要与肿瘤抑制蛋白乳腺癌1（BRCA1）相互作用，而芽殖或裂殖酵母中不存在这种情况[94,95]。
切除的第二阶段，从断裂处延长单链DNA结构几千个碱基，包括核酸外切酶Exo1或用Dna2核酸酶伪装DNA解旋酶Sgs1 [76,77]。最近，几个实验室在体外重建切除过程，使用任一芽殖酵母Sgs1/Dna2/MRX或Exo1/MRX /Sae2或哺乳动物布卢姆氏综合征蛋白（BLM）/ EXO1/MRN [96-98]。
切除术后，新产生的单链DNA被RPA涂盖以保护其不备分解，并允许RPA与Rad51的交流。RPA涂盖的单链DNA的结构可以被RPA荧光标记显影并监测修灶的外观。这种方法普遍用于至今没有能够定量衡量切除术的哺乳动物细胞中。使用这种技术，它表明CtIP，BLM（哺乳动物的同源Sgs1）或EXO1缺失导致RPA灶的结构缩小[93,99,100]，能够支持芽殖酵母中定义的这三种切除活动是保存在哺乳动物中的这一想法。?-射线辐照后减少RPA灶的形成和降低Chk1的磷酸化在Mre11核酸缺陷MEFs也观察到[85]。 这一结果是耐人寻味的，因为芽殖酵母核算缺陷Mre11突变株在DNA双链断裂不显示减少的单链DNA构成[79]。这些数据表明，Mre11核酸酶的活性，可能需要电离辐射（IR）的高效切除诱导哺乳动物细胞中的DNA双链断裂。
5．非同源末端连接或同源重组：竞争利益？
很显然，有两种蛋白质复合物可以识别DNA末端并且每一个都可以启动不同的DSB修复模式。细胞如何决定使用哪个途径呢？NHEJ和HR蛋白质互相争夺相同的DNA末端？一些研究表明，Ku确实用HR干扰双链断裂的修复[90,101-105]。更具体地说，Ku抑制芽殖酵母Exo1依赖切除，在缺乏MRN或Sae2时最明显的[80,81]。因此能够从DNA末端上去除Ku允许切除激活HR的修复似乎好主意。在酿酒酵母中ChIP的实验显示MRX复合物缺乏时在双链断裂上会增加Ku的存在，提示 MRX可以从DNA末端上取代Ku[66,81,106]。虽然这些结果可以被DNA末端上的MRX和Ku的竞争作用解释，但是MRX被芽殖酵母中高效NHEJ所需要，可与这种想法相争论[72，107]。因此看来，Ku和MRN并不仅仅竞争DNA末端，但当DSB修复青睐HR模式时，MRN可积极的从DNA末端释放Ku。
奇怪的是，尽管事实上Mre11核酸缺乏芽殖酵母的Ku异二聚体缺失可提高细胞对抗高剂量红外辐射的存活能力，从双链断裂上去除Ku时并不需要Mre11核酸酶活性[66,81]。与酿酒酵母比较，MRE11核酸酶活性对裂殖酵母中的红外辐射诱导致双链断裂的生存更为重要，但这种缺陷可被非常有效地抑制消除[80,84]。因此，研究裂殖酵母中MRN和Ku相互作用会很有趣，因为它可能揭示Mre11核酸酶活性的神秘功能。
6．同源重组细胞周期调控
虽然当模板可用于HDR时似乎使用HR活动以阻止NHEJ是合理的，但是增加了DSB修复的复杂性。如果MRN复合物不断提供绑定双链断裂并取代或积极从DNA末端释放Ku，然后NHEJ就永远不会有机会修复DNA双链断裂.这提示粘合MRN复合物到DNA末端损失NHEJ以促进HR是不够的。因为HR修复在S和G2期是更加受到青睐，可能细胞周期调节蛋白参与这个决策步骤。控制细胞周期中MRN和Ctp1活性的一个方法是调节其丰富的B型细胞周期蛋白。然而所有研究过的生物体，整个细胞周期MRN/ X蛋白复合物都是组装好的而且丰富的。另一方面，丰富的裂殖酵母Ctp1和人类同源CtIP都是细胞周期调节的，蛋白从G1期没有（Ctp1）到低（CtIP）以及S期和G2期间观察到的最高数量[90，108]。ctp1 mRNA基因的转录由MluI结合转录因子（MBF）调节，一个转录因子
?负责DNA复制和其他细胞周期调控的事件所需的大量基因的周期性表达[79]。MBF的活性由CDKs调控，因此驱动从G1到S期的转变的相同活性也可以负责ctp1?mRNA表达（图2）。鉴于Ctp1和CtIP在促进HDR中的关键作用，很可能G1后期它们的表达起始是一个主要的决定因素，以决定NHEJ转换为HR作为细胞周期该阶段的DSB修复的首选模式。
另一种可能控制DSB修复模式方式是通过翻译后修饰调节蛋白活性，如通过蛋白激酶磷酸化。CDKs是显而易见的候选者，因为触发G1-S期过渡的CDK的活性与转换NHEJ为HR作为DSB修复的首选模式的活性相同。事实上，在20世纪中期酿酒酵母的研究表明，CDK1（Cdc28）活性缺乏情况下切除会减少 [109-111]。其后，发现Cdc28磷酸化CtIP序列相似区域的Ser267上的Sae2（[112];图2）。有趣的是，在裂殖酵母，植物和一些其他物种中缺乏羧基末端，这表明进化过程中这些有机体失去了它。使Ser267突变为Sae2以取消磷酸化缩减DNA双链断裂加工并增加对DSB诱导剂的敏感性[112]。随后对CtIP研究确定了Thr847相应磷酸化，这是CDK共识序的一部分[113]。残基突变损伤了CtIP功能。CtIP在次要的位置Ser327被磷酸化，促使CtIP与BRCA1交互作用，对添补CtIP到双链断裂是必要的[94114]。奇怪的是，虽然Ctp1不管在DNA损伤基部还是上面都被磷酸化，只有基磷酸化是部分CDK依赖的，甚至不会影响Ctp1的DNA修复相关活性[115]。相反，Ctp1的DNA损伤诱导磷酸化被认为是被Ctp1通过与Nbs1相互作用定位到双链断裂所需要的[116-118]。
7．结束语
多年的鼓舞性研究，结束于一个对DSB修复过程的良好了解中。大多或者所有参与HR的蛋白质都已经了解了，更具体地说，我们对负责酿酒酵母中HR切除的核酸及螺旋酶有了一个良好的操作知识。蛋白质要求NHEJ也得具有表征。此外，有关检查点如何检测DNA损伤和调节细胞周期已大多了解，反之，细胞周期状态怎样影响细胞所使用的DSB修复模式。下一个步骤可能是切除如何被关闭方向。这可能涉及属于检查点信号通路的蛋白质。事实上，芽殖酵母中的介质蛋白Rad9（裂殖酵母中的Crb2）和哺乳动物细胞中的53BP1抑制DNA末端切除[119-121]。有趣的是，这三个同系物全都被CDK磷酸化[122-124]。这种磷酸化的影响仍有待阐明。
8．注意补充在证明
两个最新突破性研究解决了这个综述的重要课题。激活Sae2/CtIP 的Cdk1，发现还可以激活芽殖酵母中Sgs1的搭档Dna2 [125]。Ctp1，裂殖酵母Sae2/CtIP同系物，被证明对启动切除和从DNA末端释放Ku起关键作用 [126]。Mre11核酸内切酶的活性被认为对切除可有可无但对Ku的高效释放和切除后DNA的RPA积累是必不可少[126]。这些结果与缺乏Mre11内切酶活性或Ctp1的突变体强辐射敏感表型有关联[84,90]。
罗素实验室的DNA损伤的研究由NIH资助授予GM59447，CA77325和CA117638。P.L.收到荷兰科学研究组织（NWO）的财政支持。
