2013选修1《生物技术实践》知识点归纳
实验1 大肠杆菌的培养和分离
1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性（细胞壁薄，有荚膜）、兼性厌氧的肠道杆菌。
2.细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。 划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少，。划线最后，可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养10～20小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，形成菌落，不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。
涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释到10～10之间，然后去0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。
划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。
3.在培养微生物时，必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的，各种培养基也必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌（防止杂菌污染）。进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。
4.细菌扩大培养要用LB液体培养基（通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样（五类）。 人及动物的营养物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类； 植物的营养物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类；
微生物的营养物质：水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等五类。 4.无菌技术 （1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面： ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 （2）消毒与灭菌的区别 消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸灭菌、高压蒸汽灭菌(121C 15 MIN)。 5.培养基 （1）培养基可分为液体培养基和固体培养基（按照物理性质）。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。 （2）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的pH、氧气的要求（根据微生物的需求提供有氧或无氧环境）、特殊营养物质等。 碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机
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等）消毒、红外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热
碳源。单质碳不能作为碳源。 氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用N2。 （3）培养基配制的原则：目的要明确、PH值要适宜、营养要协调和要经济节约。 5．讨论和思考（P24）
（1）如何操作可以尽量避免被杂菌污染？
答：①胆大心细，操作快捷。②注意灭菌操作原则，灭菌彻底。③手和实验服要清洁。④注意微生物生长条件。 （2）在培养后如何判断是否有杂菌污染？
答：①可根据菌落形态特征来判断。②用显微镜镜检菌的形态和大小。③上述方法较难区分同类的物种，需要用化学方法进一步观察，如用革兰氏染色法。
（3）进行恒温培养时为什么要培养皿倒置？
答：冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（4）实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？
答：实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
一、教学要求
1．进行微生物分离，使用含有尿素的培养基分离有脲酶的细菌。 基本要求 2．使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。 1．说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。 发展要求 2．举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。 说明 二、基本内容 1．实验原理： 本实验以LB全营养培养基与尿素固体培养基为对照，通过观察两者的细菌菌落数说明能利用尿素的细菌在土壤菌群中较少。这两种培养基在配制时均要用琼脂糖代替琼脂使之固化。另外，由于尿素在高温下会分解，所以对尿素溶液的灭菌要采用G6玻璃漏斗过滤的方法。在尿素固体培养基中还要加入酚红，这是一种酸碱指示剂，有脲酶的细菌菌落周围会出现着色的环带。 2．实验步骤： （1）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 （2）制备培养基 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，LB全营养培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。 （3）制备细菌悬液 参考课本中P26图5的实验流程示意图，将1 g土样加入盛有99mL无菌水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液0.5mL，转移至盛有4.5 mL的无菌水的大试管中，依次等比稀释至10和10稀释度，并按照由10和10－4－5－4－5-
稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作，各做三个培养皿。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。 （4）微生物的培养与观察 将涂布好的培养皿放在37 ℃温度下培养24—48h。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。
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挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生着色的环带的颜色反应。 3．讨论和思考（P28）
（1）为什么本实验中要用琼脂糖来代替琼脂配制固体培养基呢？琼脂糖与琼脂有何区别？
答：琼脂在制作固体培养基时起凝固剂的作用。但它却是一种未被纯化的混合物，里面有一定量的含氮化合物。在本实验中所使用的尿素培养基却要求提供氮元素的物质只有尿素，用这种培养基才能分离得到含脲酶的细菌。若用琼脂来制备本实验的尿素固体培养基，则提供氮元素的物质除了尿素还有琼脂，用这种培养基就不难只得到含脲酶的细菌，还会得到大量以非尿素为氮源的细菌，这样就达不到分离出以尿素为氮源的细菌这一实验目的了。所以要将琼脂纯化，去除那些含氮化合物，这样经纯化得到的琼脂糖就可以代替琼脂做固体剂且不会带来含氮化合物对本实验的干扰了。
（2）有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？
答：有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的NH3会使土壤变成碱性，NH3与其他阴离子物质如CO、NO等形成化合物，则会使土壤板结。
（3）有脲酶的细菌周围会为什么出现着色的环带？
答：细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境中是黄色，在碱性环境中是红色。
（4）与全营养培养基上的菌落比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？
答：全营养培养基数量和种类都明显多于尿素培养基上的。因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用尿素，能存活。
（5）本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实质上一样吗？ 两者的细菌分离有很大的不同。
实验1：大肠杆菌培养和分离，利用划线分离法，从同种菌种中分离得到同种菌的单菌落，在划线的末端出现大肠杆菌单菌落。
实验2：分离以尿素为氮源的微生物，利用涂布分离法，从土壤浸出液里所存在的各种细菌中只将含有脲酶的细菌分离出来，只出现含有脲酶的细菌菌落。
实验4 果汁中的果胶和果胶酶
1.果胶是植物细胞壁的以及胞间层的主要成分之一，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。下面是果胶的结构式：
山楂的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是由于果胶的作用。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。
果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。
2.果胶是植物细胞壁和胞间层的主要组成成分之一。在果汁加工中，果胶的存在易导致果汁出汁率低，果汁浑浊。果胶酶分解果胶的作用是：①瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易；②把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清，因此可以解决果汁加工中出现的问题。果胶酶是一类酶的总称，包括：多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶。在植物细胞工程中果胶酶的作用是与纤维素酶一起除去植物细胞的细胞壁。
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3.黑曲霉 苹果青霉可用于生产果胶酶。
（1）制作果汁的最佳条件是什么？
答：制作果汁的最佳条件是方法要温和，且对人体无害，能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中，能尽量保留水果的营养成分，具有水果的原始色彩和口味；有更多的固形物，分散程度好，不沉淀，不上浮；除去所有的机械组织，更易消化。
（2）果胶酶在制作果汁中起什么作用？
答：可将细胞离析，增加固形物的分散度。降低水果匀浆悬液黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。 （3）果胶酶还可能起什么作用？
答：果酒澄清，同时也作为洗衣粉的添加剂，有利于洗去衣服上的果汁等污垢。
（4）果胶酶水解果胶的最终产物是什么？要使果汁澄清，是否应该同时使用果胶酶和果胶甲酯酶中的哪一种？还是同时使用两种酶？为什么？
答：果胶酶水解果胶的最终产物是半乳糖醛酸，要使果汁澄清，应该同时使用果胶酶和果胶甲酯酶。从微生物中获得的果胶酶都包括这两种酶。因为，如果不使用果胶完全降解成半乳糖醛酸，则不可能减少组织的分散性，许多水果中的固形物不能除去，这样会降低果汁的营养成分，也影响其澄清度。
实验7 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解
1．实验原理
固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。 固定化酶方法：吸附法、交联法、包埋法、共价偶连法等。固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。
固定化酶的优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；固定在载体上的没可以被反复利用。
实验操作
实验原理：本实验是用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。
2．实验步骤
（1）α淀粉酶的固定化。5mg α淀粉酶溶于4ml蒸馏水，加入5mg石英砂，搅拌30min。
（2）将石英砂装入含气门心并用夹子封住的注射器中。用40ml蒸馏水用流速1ml/min来洗涤除去未吸附的游离淀粉酶。 （3）使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱，在流出5ml后接收0.5ml流出液。加入1-2滴KI-I2溶液，观察颜色变化。 实验预期结果：水解产物糊精遇碘呈红色。 3．讨论和思考（P40）
（1）如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？
答：可在试管中加入1ml可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶了。
（2）耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？
答：在高温下使淀粉水解快，不会因为温度高而失活，发酵生产中经常要用到植物淀粉水解。
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