实验时间 4月11日 4月18日 4月25日 实验内容 实验一 培养用液的配制、除菌与分装 实验二 细胞的传代培养 实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401 实验四 染色体制备（6-10组）301 5月2日 实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401 实验四 染色体制备（1-5组）301 5月9日 实验五 细胞的复苏与冻存
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实验一 培养用液的配制、除菌与分装
【实验目的】
1. 掌握常见培养用液的配制方法。 2. 掌握常用的灭菌方法。 3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】
常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】
试剂：NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS
材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜
仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱
【实验分组】
实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶 50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
【实验步骤】
1．PBS（1000mL）的配制
分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g ；KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。
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2．胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制、除菌与分装
称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。
3．EDTA（0.2％）的配制、除菌与分装
称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容量瓶里，终浓度为0.2%，用浓盐酸，调pH为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。
在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。 4．培养基的配制、除菌与分装
将培养基干粉（MEM或PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。
工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。
将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶90 mL，余下装入500 mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1%。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 ℃冰箱保存备用。标签上标明：MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。
用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10%。
【注意事项】
1. 滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是
抽滤法除菌。
2. 培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无
菌的液体，终浓度为100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素。
【思考题】
1. 配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，为什么？如何调节培养液的pH？ 2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？ 3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？
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实验二 细胞的传代培养
【实验目的】
1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。 2. 了解细胞传代培养的意义。
【实验原理】
细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28℃，冷水鱼类细胞为15-20℃，水生哺乳动物细胞为37℃。
细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。单纯换液不需要接种细胞。
【试剂、材料与仪器】
试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA
材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜
仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱
【实验分组】
实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
【实验步骤】
工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。
1． 观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时
可以传代；
2． 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于
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