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氧化损伤与遗传毒性的检测研究概况
作者：吕惠萍 朱琪
来源：《安徽农业科学》2015年第14期
摘要 概述了氧化损伤与遗传毒性的分子毒理学评价手段。简单介绍和讨论了活性氧自由基（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽解毒酶（GST）、丙二醛含量（MDA）、DNA损伤等生物学指标在毒理学领域的研究现状，重点探讨了彗星实验技术（SCGE）在检测遗传毒性方面的应用情况。
关键词 活性氧化基；抗在毒理学领域，传统的毒性测定方法对于判定污染物对生物的毒性效应必不可少，但已不能满足评价和预测外来污染物对环境生物的早期毒害情况的需求。已有的数据大多集中在污染物对指示生物的急性毒性、慢性毒性以及对生物的繁殖行为、生长情况的影响。但是，由于环境中污染物的浓度增加而引起的生物死亡、生长受阻，繁殖能力下降导致的生态系统破坏，已属于污染的晚期影响。并且，在污染早期，许多污染物含量都较低，达不到致死或影响生物生长的水平。因此，采用更加敏感的研究手段有利于预防早期污染。 在污染物进入环境后，对生物的作用开始在个体的分子水平上，然后在细胞、器官、个体、种群、群落、生态系统等各个水平上显现出来[1]。所以，要分析污染物在各个水平和预测少量污染物对个体的潜在影响，尽早避免或减轻环境污染具有重要意义[2]。一些污染物在生物体内的代谢反应中会导致体内活性氧自由基增多，产生氧化应激。生物体自身的生化反应如酶类参加的反应会降低污染物的产生，反之，过量的自由基会对生物大分子如酶类、脂质、蛋白质、DNA造成损伤。污染物对生物体的氧化损伤和遗传毒性已成为毒理学领域中的一个研究热点，也是能够早期预测污染物的生态毒性效应的一个重要方面。该研究简要论述了氧化损伤与遗传毒性的分子毒理学评价手段的最新进展、发展趋势、研究热点以及应用情况。 1 活性氧自由基（ROS）概述 1.1 ROS的产生
ROS是生物体内生理性氧的代谢产物，在线粒体呼吸链部位由单电子传递给氧而产生，是引起蛋白质氧化损伤的重要因素。ROS具有很强的化学活性，主要包括超氧阴离子（O2-）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）和脂质过氧化物的中间产物——烷氧自由基、烷过氧自由基等[3]。许多疾病、生命的衰老（特别是衰老性疾病）都涉及活性氧自由基反应。近年来，活性氧的检测及抗氧化药物的筛选在多个领域受到高度的重视。
ROS在生物体内的产生过程主要有酶反应和非酶反应，其中ROS产生的主要途径是与线粒体呼吸链有关的酶的反应，而且这些ROS可以被机体所利用，显示出十分重要的生理功能。Chance等[4]证明，产生ROS的重要场所是线粒体。在正常的生理情况下，线粒体需要消耗约2%的氧产生的ROS，由呼吸链底物端释放出电子还原氧分子单电子，产生ROS的前体
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——超氧阴离子和过氧化氢。另外，一些外源性污染和刺激也能够导致机体内ROS的增加。有研究表明，温度、含氧量、盐度、过渡金属离子、农药等因素都能够诱导水生生物体内的ROS[5]。朱茂祥等[6]用一系列剂量的γ射线照射细胞，细胞内ROS显著的增加。Song等[7]发现，六氯苯或过氯苯可以引起鲤鱼肝脏和大脑的氧化应激状态。虽然六氯苯作为一种持久性有机污染物已被斯德哥尔摩公约在全球范围内禁止使用，但由于很多是工业过程的副产品，仍然持续地向环境中释放。六氯苯引起机体ROS的增加，有两个原因：一是作为脂溶性化合物，它可以与细胞色素结合而不易代谢，如此便拆开单加氧酶反应的电子转移链，结果有利于活性氧自由基的产生；二是六氯苯的主要代谢物五氯苯酚是潜在的ROS产生源。 1.2 ROS的清除
在正常的生理条件下，机体产生和清除ROS处于一个相对平衡的状态。但是，在特殊生理条件或在外界的刺激下，体内ROS会不同程度地增加。生物体自身的代谢过程可以清除ROS，维持平衡状态。
生物体内ROS清除剂包括以下两类物质：一类是在抗氧化条件下，机体本身具有的酶系统和抗氧化剂；另一类是在病理条件下，加入外源抗氧化酶和抗氧化剂。抗氧化酶有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSPPx）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）等。抗氧化剂主要有以下3种：一类是水溶性抗氧化剂，包括N-乙酰半胱氨酸、白蛋白、VC等；另一类是脂溶性抗氧化剂，包括金属络合物、VA、VE、激素类、胆红素等；另外，硒、铜、锌等微量元素也可以间接地清除ROS。研究表明，ROS最强清除剂是番茄红素[8]。VE作为天然的脂溶性抗氧化剂，对保护生物膜、脂溶性蛋白免受氧化损伤也有重要的作用[9]。
1.3 ROS的生物学意义
生物体产生的ROS可以被机体所利用，并发挥十分重要的生理作用。首先，ROS可以参与核苷酸的还原、胶原蛋白合成、凝血酶原的合成等。而且，ROS可以参与杀菌和体内解毒。其次，ROS是机体细胞、组织、器官的产生和生长的重要信号分子。Sauer等[10]研究表明，ROS能促进胚胎心脏的生长和分化，同时ROS清除剂可抑制心肌的正常生长发育。Huang等[11]研究发现，如果将ROS的清除剂如乙酞水杨酸、N-乙酞半肤氨酸等用在铬（VI）诱导的细胞凋亡中，那么会使凋亡的细胞减少。
过量的ROS会导致细胞损伤或细胞凋亡。ROS的活泼性和氧化反应能力都很强，能通过氧化作用攻击细胞的生物大分子物质（核酸、蛋白质、糖类、脂质）。过量的ROS可与脂质分子发生过氧化反应，使得破坏细胞膜的通透性遭到破坏，而且可以使蛋白和蛋白酶变性或失活；或者通过碱基修饰损伤DNA，进而影响基因的表达。有研究表明，ROS与脂质分子的过氧化作用形成大量的脂氢过氧化物，对人体正常肺细胞中的蛋白质和DNA等生物大分子造成损伤。
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1.4 ROS的检测
自由基具有性质活泼和反应性强的特点，既易还原又易氧化，其本身并不稳定。其检测手段有以下几种：电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、气相色谱法、化学发光法、荧光分析法、分光光度法以及电化学方法。但是，这些检测手段能够直接测定的方法相当有限，所以在环境、医学等领域迫切需要开发直接测定活性氧或其他自由基的检测方法。 2 氧化损伤的生物学指标概述
由于污染物会引起生物体内活性氧自由基的大量产生，直接或间接地导致酶变性失活或诱导其活性增强。过量的ROS也能与脂质发生过氧化反应产生MDA，进一步损伤生物大分子，破坏遗传物质。已有的研究常用抗氧化酶活性、解毒酶活性、脂质过氧化产物——丙二醛（MDA）、ROS、DNA损伤等指标评价污染物引起的氧化损伤程度[12-13]。 2.1 抗氧化酶系
需氧生物为了阻止氧化损伤，机体形成有效的保护机制，做出相应的改变来适应外界环境。抗氧化酶能够减缓氧化的速度，使生物体内活细胞产生催化剂，其中抗氧化酶系统在这种保护机制中起重要作用。抗氧化酶系统主要包括超SOD、CAT、过氧化物酶（POD）。 SOD是广泛存在于动物植物微生物中的一类金属酶，是一种源于生命体的活性物质，主要功能是清除超氧阴离子，减轻氧化环境对机体的胁迫，保护其他生物大分子免受损伤。真核生物的SOD有3种形式，即细胞内CuZnSOD（CCuZnSOD）、细胞外CuZnSOD
（ECCuZnSOD）和线粒体MnSOD。CCuznsoD主要分布在细胞质和细胞核中，ECCuZnSOD主要存在于细胞外的血浆、淋巴、腹水、脑脊液中，MnSOD位于线粒体上[14]。SOD能把超氧自由基转换为过氧化物和氧气，其反应机理如下：2O-2 + 2H+ → H2O2+O2。过氧化氢可被CAT和POD清除。
CAT又称为触酶，是一种以铁叶琳为辅基的结合酶。CAT普遍存在于大多数生物体内，主要存在于植物的线粒体、叶绿体、内质网、动物的肝和红细胞中。肝脏中过氧化氢的清除速度很快，就是由于它的CAT酶含量很高。CAT催化体内H2O2分解为分子氧和水，使得细胞免于遭受H2O2的侵害；同时，H2O2与O-2会在铁螯合物作用下生成有害物质OH-[15]，CAT也能有效避免。其清除反应如下：CAT+H2O2→复合中间物Ⅰ+H2O；复合中间物Ⅰ+H2O2→CAT+H2O+O2。CAT是已知的最高效的酶之一。过氧化氢浓度越高，其分解速度越快。有研究表明，某些污染物可以与CAT的硫基或其他基团发生作用，改变其活性，构成毒性效应[16]。
POD也被认为是生物保护酶之一，在许多植物和动物中普遍存在。POD通过一个二质子、二电子还原过程催化过氧化氢对底物AH的氧化：H2O2+ 2AH → 2H2O+ A2。其作用是催化过氧化氢与对各种有机物和无机物氢供体之间的氧化反应，具有消除过氧化氢和酚类、胺类
