miRNA表达谱测序
miRNA表达谱测序
背景介绍
Small RNA是一类长度在20～30nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA和piRNA。Small RNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。采用HiSeq 2000进行Small RNA测序，一次性获得10M 49nt的原始reads，能够快速鉴定特定条件下表达的已知Small RNA并发现新的Small RNA，同时还可以研究不同条件下Small RNA的表达差异。
技术路线
连接3'RNA接头连接5'RNA接头Illumina Hiseq2000平台测序总RNA提取 RT-PCR纯化Small RNA文库
生物信息学分析
测序原始数据 数据处理及长度 分布 数据处理内容 数据去杂 miRNA表达量统 计 miRNA预测及 表达分析 miRNA及其余 sRNA与哺乳 动物已知 miRNA比对
重复序列合并 已知miRNA 表达分析 与Rfam数据库对比 从mirbase提取哺乳动物miRNA成熟体及前体与Myotis lucifugus基因组比对预测新miRNA 与Pteropus_vampyrus基因组比对预测新预测出的miRNA与哺乳动物miRNA前体对比 剩余sRNA与哺乳动物miRNA前体对比 与基因组比对 送样要求
样品要求
1. 所需Total RNA的量均不少于20μg/文库，Total RNA可以保存在DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。 2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g； 3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g； 4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞； 5. 如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml的样品。
我们强烈建议在送样的同时客户做好备份，以备后续实验之用。
样品纯度要求
1. OD260/OD280在1.8-2.0之间，RNA无降解、28S和18S核糖体RNA条带非常亮且清晰（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），28S的密度大约是18S的2倍；Agilent 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8。
2. 无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理。
请提供至少一种样品的凝胶电泳或者Agilent 2100检测仪检测图片，并注明其浓度、体积、OD260/OD280、溶剂名称、制备时间、物种来源以及特别备注。最终以我方定量、质检为准。
样品采集
为了保证提取RNA的完整性，确保后续实验的顺利进行，请务必确保样品的新鲜，对于如何确保样品的新鲜针对不同的样品获取材料的方法如下：
1. 动物组织：从活体上迅速的取下组织（切成黄豆粒大小的块状），每切成一个黄豆粒大小的块状立即放入液氮中，重复上述操作，直至足够提取总RNA的量；准备一个50ml的离心管，做相应的标记（样品名称、编号、客户姓名、时间），最好既在管盖上做好标记，也在管壁上做好相应的标记，先放入液氮中预冷2-3min，拿出离心管（离心管的下部分还是保持在液氮中），打开离心管的盖子，将液氮中黄豆粒大小的块状收集进离心管中。 2. 植物组织：
（1）如所采集的是果实、麦穗等体积偏大的样品，收集样品请参照1.动物组织取样方法； （2）如采集的是叶片等体积偏小的样品，请尽量采集嫩叶、幼芽等，每采集一片叶片立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量，后续操作请参照动物组织的采集。
（3）如是植物的花，在采集花骨朵的时候请尽量不要采集到花萼、叶片等，每采集一个花骨朵请立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量；后续操作请参照动物组织的采集。 3. 如提供实验材料为菌丝体，请取500μl的菌液于1.5ml离心管中，离心去上清，剩余菌丝体放入液氮或干冰中，请提供不少于5管的菌丝体。
样品运输
从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。请填写完整订单，放入自封袋中与样品一起邮寄。为防止RNA的降解，请确保干冰的量足够运送到目的地。 我们强烈建议在寄送RNA样品时将RNA保存在75%的乙醇或异丙醇中。
如是特殊样品，关于送样量和保存问题请与我们联系沟通，以便双方共同协商解决。
提供结果
根据客户需求，提供不同深度的序列分析结果
