模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/?l，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
5．Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200?mol/l时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚合酶均有相应的缓冲液，而Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无Mg2+的缓冲液，，在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。
三、PCR反应特点
PCR反应具有以下特点： 1．强特异性
PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与模板DNA特异性的结合；（2）碱基配对原则；（3）Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；（4）靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
2．高灵敏度
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（?g = 10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
3．快速简便
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性－退火－延伸反应，反应一般在2～4小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。
4．低纯度模板
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可直接用临床
标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
第二节 PCR扩增反应的实施
一、PCR反应的条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 1．温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。
（1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃ lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
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（2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值（解链温度）=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
（3）延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃，150核苷酸/S/酶分子；70℃，60核苷酸/S/酶分子；55℃，24核苷酸/S/酶分子；高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。
（4）PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
2．循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
二、PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
1．凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
（1）琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
2．酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
3．分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
4．Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
5．斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
6．核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
三、PCR结果异常分析
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
1．假阴性，不出现扩增条带
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PCR反应的关键环节有：① 模板核酸的制备；② 引物的质量与特异性；③ 酶的质量及活性；④ PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
（1）模板：① 模板中含有杂蛋白质；② 模板中含有Taq酶抑制剂；③ 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④ 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；⑤ 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：
① 选定一个好的引物合成单位。
② 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20?l、30?l、50?l或100?l,用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20?l后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2．假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。可能的原因是： （1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：① 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。② 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③ 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3．出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二
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聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：① 必要时重新设计引物。② 减低酶量或调换另一来源的酶。③ 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④ 适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
4．出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：① 减少酶量，或调换另一来源的酶；② 减少dNTP的浓度；③ 适当降低Mg2+浓度；④ 增加模板量，减少循环次数。
通常情况下，打开试剂产品（引物，酶等）之前，要注意一下方面：
1． 保存温度 2． 保质期
3． 做适当离心，并做试剂（高浓度）分装，可防止污染浪费、反复冻融并易稀释成其他浓
度。分装过程注意防止污染（如采用双蒸水灭菌后分成小管单独保存于冰箱作为PCR专用水；进行无Nase和RNase处理等等）。
反应体系以20uL-100uL为宜，若选取50uL,则可按照顺序依次加入一下物质：
PCR专用水 41uL 38uL Buffer 5uL 5uL P1、P2 各1uL 或 各1uL
dNTP 1uL（10mM） 4uL (2.5mM) Taq酶 0.5uL 0.5uL 最后加入模板0.5 uL。
注意：1.设置对照组，阴性对照必须有，阳性对照可选。
2．可先配多管的体积，混匀再分装，并可多做一管的反应量，减少误差。
PCR参数的设定:
99℃预热5min 94℃变性30s
55℃退火30s 25-35个循环 72℃延伸1min 72℃延伸7min
完成后可在PCR仪作15℃保存。
最后做琼脂糖凝胶电泳，电泳胶的浓度和体积根据实际需要确定。
采用天根（TIANGEN，天根生化科技有限公司）2×HosStart Taq Master Mix，该产品包含HotStart Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2×。
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