1h（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。然后取下并使之冷却。
提示：控制加热温度是关键！ 想一想： 1、为什么要必须将烧瓶冷却数分钟以后再加入H2O2？ 2、若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，还可采用什么方法将其冲下？ 3、实验中若出现大量泡沫将要冒出该如何处理？ （四）定容 将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20mL蒸馏水摇匀放冷，小心转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，加水至刻度线定容，静置至室温，混匀备用。同样条件下做一试剂空白试验。
注：在消化完全后，消化液应呈清澈透明的兰绿色或深绿色（铁多）,故CuSO4在消化中还起指示作用。
同时应注意,凯氏瓶内液体刚清澈时并不表示所有的N均已转化为氨,因此消化液仍要加热一段时间。 想一想：1、空白实验如何操作？ 2、如何保留玻珠在凯氏烧瓶中？ 3、为何要将凯氏烧瓶洗至中性？ （五）蒸馏 1、水蒸汽发生器的准备：按要求安装好定N装置，保证管路密闭不漏气。在水气发生瓶内装水至2/3处，加甲基橙指示剂3滴，及1mL～5mL硫酸，以保持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸使成为（NH4）2SO4形式固定下来，使蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热至沸腾。 想一想：调整水蒸汽发生器内水呈酸性的目的是什么？ 2、清洗凯氏定氮仪：打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸5min～10min，冲洗定N仪、样杯、碱杯和内室。分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气口！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少量水，冲洗再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。
3、吸收液准备：在250mL锥形瓶中加入10mL(20g/L)硼酸溶液和1滴～3滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。
想一想：（1）20mL(20g/L)硼酸溶液需要准确吗？ （2）冷凝管下端不插入液面下可以吗？ 5 （3）硼酸吸收液过多过少有何影响？
4、蒸馏准备：准确量取10mL消化溶液，由样杯加入定氮仪内室，并用10mL水冲洗样杯，但内室中溶液总体积不超过内室的2/3（约50mL），盖上棒状玻塞，加水至杯口1cm～2cm，以防漏气，关闭排队液口，迅速由碱杯加入10mLNaOH溶液（400g/L）（溶液应呈强碱性，注意内室颜色变化），通入蒸汽开始蒸馏。
注：NaOH必须充分，即在反应中是过剩的，保证消化液中的硫酸铵完全转变为氨气，故，Cu2SO4还可在碱蒸馏时作为碱性反应的指示剂：
CuSO4+2NaOH（要充分）→Cu(OH)2（棕褐色）+Na2SO4 5、蒸馏：关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），使NH3通过冷凝定而进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏5min，移开接收瓶，使冷凝管下端离开液面，让玻璃管靠在锥形瓶的瓶壁，继续蒸馏1min。同时，用蒸馏水冲洗冷凝管下端，将洗液一并聚集于硼酸溶液中。
注：蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接受瓶。火力太弱，蒸馏瓶内压力减低，则接受瓶内液体会倒流，造成实验失败。 想一想：1、若蒸馏中停电或其它情况供气压力骤减，该如何处理？ 2、为什么在蒸馏结束后用蒸馏水冲洗冷凝管下端？ 6、收尾：关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲洗内室，待洗液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。
按上述步骤，换下一试样蒸馏，同时准确吸取10mL试剂空白消化液作空白实验。
（六）滴定
取下接收瓶，用0.05MHCL标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。【GB/T5009.5-2003】
将已吸收氨的硼酸液用已标定的0.0500mol/L的标准硫酸或盐酸溶液滴定，滴定至三角瓶中溶液由蓝绿变灰紫为终点，记下耗酸体积。每次消化液须重复蒸馏2～3次。如果几次滴定酸量相差较大，必须重新蒸馏。直至滴定时耗酸量相差不超过0.05mL为止。（教材）
【GB/T5413.1-1997】用硫酸标准溶液滴定至溶液出现酒红色为止，记录
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所用硫酸标准溶液的体积。同时进行空白试验，并在结果中加以校正。
想一想：微量滴定管如何使用？
注意观察实验中用0.05MHCL标准溶液滴定时溶液的变色变色情况。 六、数据记录与计算 （一）数据记录：见下表
?※※试样中蛋白质含量测定原始数据记录表： 样品名称 空白实验 盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L） （二）结果计算
?F?10010m?100?式中：X—样品中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL；
X?样品质量（g） 标准酸液耗量（mL） ?V1?V2??c?0.0140?V1—样品消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；
?V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；
?c—硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L； ?0.0140—1.0mL盐酸[c(HCl)=1.000mol/L]或硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000mol/L]或标准滴定溶液相当的氮的质量，g；
?m—样品的质量或体积，g或mL； ?F—氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25。大豆及其制品为5.71。
?计算结果保留三位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
想一想：公式中各种数字和符号的意义！ ?七、注意事项（见教材P116） ?八、实验结果与分析讨论 （一）检测结果及质量评价
说明检测结果，根据检测结果和产品质量标准，对试样质量作出评价。 （二）分析讨论
1、试样加入浓硫酸后，颜色有什么变化？总结消化中颜色的变化，试分消化过程中的颜色变化的化学实质？
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2、消化完全的标志是什么？加快消化的措施有哪些？
3、消化过程中所加试剂的作用是什么？
4、蒸馏前加入氢氧化钠后定氮仪内室溶液颜色发生了什么变化？试分析氢氧化钠在蒸馏中的作用？
5、如何确定蒸馏完全？为什么蒸馏结束将冷凝器尖端离开接收瓶液面后，还要蒸馏1min？
6、观察滴定中溶液颜色变化，微量滴定管在使用时应注意哪些问题？ 7、说明你对本实验的体会。 8、试画出定氮装置的结构示意图。
9、试分析实验中可能导致误差的因素及应对措施？ 九、课后作业：（另附作业上交）?
1、凯氏定氮法测定蛋白质的依据是什么？
2、试述凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要？
3、什么是蛋白质换算定系数？为什么不同试样蛋白质换算定系数不同？ 4、凯氏定氮法测出蛋白质是试样中准确的蛋白质含量吗？为什么？ 附:【GB/T5009.5-2003食品中蛋白质的测定】第二法
一、原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氢化吡啶化合物.在波长400nm处测定吸光度,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。
二、试剂
1、硫酸铜。2、硫酸钾。3、硫酸。 4、氢氧化钠溶液(300g/L)：称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。
5、对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L)：称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95%乙醇中，加水稀释至100mL。
6、乙酸溶液(1mol/L)：量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL。
7、乙酸钠溶液(1mol/L):称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠(CH3000Na23H20)，加水溶解后并稀释至500mL。
8、乙酸钠一乙酸缓冲溶液:量取60mL乙酸钠溶液(1mol/L)与40mL乙酸溶液(1mol/L)混合，该溶液为pH4.8。
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