桂林理工大学生物工程专业《生物分离工程》实验讲义
实验一 牛乳中酪蛋白的提取
一、实验目的
1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作； 2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。
二、实验原理
酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。
在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。
三、材料与试剂
市售牛奶
10mg/mL酪蛋白标准溶液（用0.1M NaOH配制） 0.1M NaOH溶液、0.2 M pH4.6的HAc－NaAc缓冲液
双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5 g，加水100 mL，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500 mL水中。两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH 300 mL，后用水稀释至1000 mL，贮存于塑料瓶中。此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。
四、操作步骤
1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀
用量筒量取25 mL牛乳两份分别置于50 mL 烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2 M pH 4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30 min沉淀酪蛋白后，3000 r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀。一份沉淀用于 “除杂”步骤，另一份沉淀用0.1M NaOH溶液溶解并定容至100 mL，用于“酪蛋白含量测定”步骤。
2、除杂
将上述沉淀捣碎，加入10 mL 95%乙醇，搅拌制成悬浮液。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10 mL乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10 mL乙醚洗涤沉淀两次，抽干。
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将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m1）。
3、酪蛋白含量测定
（1）标准曲线的绘制
分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于干燥试管中，不足1.0 mL者用0.1M NaOH
溶液补足1.0 mL，然后分别加入4.0 mL双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度。以酪蛋白质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （2）酪蛋白含量测定
取―步骤1‖中样品溶液1.0 mL，加入4.0 mL双缩脲试剂，混匀，室温下反应30 min，测定540nm波
长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。平行测定3次，求其平均值，并计算25 mL牛乳中酪蛋白的质量（m2）。
五、结果与讨论
1、牛乳中酪蛋白含量的计算
含量（g/mL）=
2、酪蛋白提取得率的计算
得率（%）=
m2?100
牛乳体积（25mL）m1?100%
m2?100六、思考题
1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？ 2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？ 3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？
4、比较牛乳中酪蛋白测定含量与理论含量大小，并对测定结果进行讨论。
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实验二 大蒜细胞SOD酶的提取与分离
一、实验目的
1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤；
2、掌握酶在提取过程中的两个重要参数：回收率和纯化倍数。
二、实验原理
超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、试剂和材料
新鲜蒜瓣，市售
磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8
氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿﹕无水乙醇=3﹕5（V/V） 丙酮：用前冷却至4～10 ℃
0.1 mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2 mmol/LEDTA） 10 mmol/L HCl
45 mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）
四、实验步骤
1、组织或细胞破碎
称取5g左右大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨，使组织或细胞破碎。 2、SOD的提取
将上述破碎的组织或细胞，加入 2～3倍体积（10-15 mL）的 0.05 mol/L，pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000 r/min下，离心 15 min，收集上清液得提取液。
留出1mL备用，剩余提取液准确量取体积后进行下步实验。 3、除杂蛋白
提取液加入0.25倍体积的氯仿一乙醇混合溶剂搅拌15min，5000r/min离心15 min，去杂蛋白沉淀，收集上清液得粗酶液。
留出1mL备用，剩余粗酶液准确量取体积后进行下步实验。 4、SOD的沉淀分离
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将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000r/min离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于少量（5ml）0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液中，再加水5mL，5000r/min离心15min，收集上清液，得SOD酶液。准确量取体积。
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力和蛋白浓度。 5、SOD活力测定
参照李建武的《生物化学实验原理和方法》，采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活力。邻苯三酚在碱性环境中即可迅速发生自氧化作用，在自氧化过程中产生有色中间物和O2-自由基，反应开始后溶液逐渐变成黄色，在有超氧化物歧化酶存在时，由于它能催化O2-自由基与+H结合生成02和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，降低了自氧化速率。中间产物在325nm时有强力的光吸收，采用分光光度计即可检测。
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定：
在试管中按表1加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算邻苯三酚自氧化速率k0（直线斜率）。
表1 邻苯三酚自氧化测定加样表
试 剂
0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）
蒸馏水 10mmol/L HCl
45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）
总体积
加 样 量 （mL） 校零管 4.5 4.4 0.1 —— 9.0
测定管 4.5 4.4 —— 0.1 9.0
（2）SOD酶活的测定：
在试管中按表2加入各试剂，加入邻苯三酚后马上计时，迅速摇匀倒入石英比色皿中，在325nm波长下，从第1分钟开始，每隔30秒测一次光吸光度，测至第5分钟。以吸光度为纵坐标，反应时间（min）为横坐标绘制反应曲线，计算加入SOD酶样品后的邻苯三酚自氧化速率k1（直线斜率）。
表2 SOD酶活测定加样表
试 剂
0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA）
蒸馏水 10mmol/L HCl 待测样
45mmol/L邻苯三酚（内含10mmol/LHCl）
总体积
加 样 量 （mL） 校零管 4.5 4.3 0.1 0.1 —— 9.0
测定管 4.5 4.3 —— 0.1 0.1 9.0
（3）酶活力测定
酶活性单位定义为：在lml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个
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