2015年版微生物检查培训
微生物检验包含微生物限度检查和控制菌检查
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求,检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定，所选的方法适用性须经确认。
供试品检查：
1.供试液的制备：稀释剂为pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，取10g供试品稀释成1:10 1:100的供试液。
2.微生物限度检查：计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。
①平皿法又包括倾注法和涂布法。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。需氧菌总数：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）在30～35℃培养3～5天；霉菌和酵母菌总数：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）在20～25℃培养5～7天，观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数,计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。 点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
菌数报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级,作为菌数报告的依据.取最高的平均菌落
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数计算1g,1ml或10cm供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
②薄膜过滤法：取相当于1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量稀释液中，立即过
滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于TSA或SDA上培养。培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
菌数报告规则：以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数，或＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
3.控制菌检查：以大肠埃希菌为例：阴性对照（稀释剂）；阳性对照（供试液+菌液）；
供试品检查（供试液）
1:10供试液至tsb（适宜体积）30-35℃（18-24h）
MaC肉汤 → MaC琼脂 （大肠+/金葡-） （大肠+指示） 42-44 ℃ 24-48h 30-35℃ 18-72h
结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。
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所用的培养基应进行适用性检查：同一批新购入的脱水培养基可只进行一次适用性检查试
验，按照生产商附有的使用说明、灭菌条件和处方等进行配制，与中检院购入的相应的对照培养基同条件下进行接种培养。
①计数用培养基应计算各菌种的回收率。即被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5~2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
②控制菌检查用培养基的检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性（能力）。
检验方法适用性试验：平时检验需按照验证过的方法进行。验证所用的培养基均应进行培养基适用性检查。
①计数方法适用性试验：所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%，为确认供试品中的微生物能被充分的检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行试验。
Ⅰ:试验组 取供试液加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中的含菌量不大于100cfu。
Ⅱ：供试品对照组 取供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
Ⅲ：菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。 若供试品有抗菌活性或溶解性较差，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加入试验菌液进行方法适用性试验。 注意点----抗菌活性的去除或灭活
⑴增加稀释液或培养基体积 ⑵加入适宜的中和剂或灭活剂
⑶采用薄膜过滤法 ⑷上述几种方法的联用
②控制菌检查方法适用性试验：
试验菌：根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应的试验菌株。见表一。
试验时按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中：采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。
限度标准由“数量”向“数量级”转变
非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（通则1105）检查；非无菌药品的控制菌照“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”（通则1106）检查。各品种项下规定的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数标准解释如下： 101 cfu: 可接受的最大菌数为20; 102 cfu: 可接受的最大菌数为200;
103cfu: 可接受的最大菌数为2000:以此类推。
虽然扩大了限度的标准，但是对过程控制的要求有了很大的提高，培养基的营养能力也有了很多的提高，未来将向参数放行方向发展
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表一：非无菌化药的微生物限度标准 给药途径 制剂类型 口服给药 固体 液体 口腔黏膜/牙龈/鼻用 耳用/皮肤 局 部 用 药 呼吸道 尿道/阴道 直肠给药固体 液体 其他局部给药
需氧菌霉菌和酵母菌 总数 总数 103 102 102 102 102 102 103 102 102 102 101 101 101 101 101 102 102 102 控制菌 大肠埃希菌；含药材原粉的化学药品制剂及含脏器提取物的制剂不得检出沙门菌 大肠埃希菌，金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 大肠埃希菌，金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌 金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，白色念珠菌，梭菌（中药） 金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 金色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 第 3 页 共 3 页
