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实验5 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化和筛选
实验目的
1、 了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作方法。 2、 了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
实验原理
该技术是将外源DNA分子引入大肠杆菌细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。细胞经过一些特殊方法（电击法、氯化钙、Rbcl/Kcl等）处理后，细胞膜的 通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。
在实验室中感受态细胞的制备经常用到的是氯化钙法，该方法的原理是将快速生长中的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙中，便会造成细胞膨胀（可能局部原生质体化），使细胞处于容易吸收外源DNA 的状态。
质粒DNA转化大肠杆菌目前主要采用的是热激法，其原理是大肠杆菌在0℃氯化钙低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNased的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，使处于感受态的大肠杆菌细胞吸收DNA复合物，在未加抗生素的培养基生长一段时间后,大肠杆菌细胞复原并重新开始分裂增殖.由于在被转化的细胞中,重组子基因得到表达,在含有抗生素的培养基平板上可挑选所需的转化子。
在分子生物学技术中的一类用于选择转化细菌的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨卡青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性基因，这些基因被构建在质粒载体上。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以筛选得到转化的基因。
实验步骤
1、
感受态细胞制备（小量制备）
（1） 从LB平板上挑取新活化的PBluescript菌落，接种培养，直至对数生长
后期，，将该菌悬液以1:100~1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600=0.5左右。
（2） 取1ml细菌培养物置于1.5ml的EP管中，冰浴15min,8000r/min，离心
1min，收集菌体，冰浴放置。
（3） 取1ml的预冷的氯化钙悬浮菌体，8000r/min，离心1min，收集菌体，冰
浴放置。
（4） 取1ml的预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴30min，8000r/min，离心1min，
收集菌体，冰浴放置。
（5） 加入200μl预冷氯化钙，即得可用于转化的感受态细胞。
2、 质粒在大肠杆菌中的转化
（6） 将上述得到的感受态细胞中加入2μl质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放
置30min.
（7） 42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上4min. （8） 向管中加入1mlLB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养1h，
使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Amp）。 （9） 将上述菌液摇匀后去100μl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置
2min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12~16h.
3、 设置对照组
(一) 受体菌对照（检验受体菌是否含有质粒）
在上述步骤（6）中在感受态细胞中加入2μl的质粒改为加2μl的水，别的如上述步骤操作。
（二）质粒对照组（检验质粒是否受到污染）
在EP管中加入200μl的预冷的氯化钙，再如上述（6）~（9）步骤进行
实验结果与分析
质粒对照组 受体菌对照组
实验组
实验结果：
此次实验为大肠杆菌感受态细胞的制备、转化和筛选，
步骤主要为用氯化钙法制备感受态细胞以及用热激法来将质粒DNA转化大肠杆菌筛选，从而得到大肠杆菌感受态细胞，我的实验结果如图所示
分析：
一、 从质粒对照组以及实验组中无杂菌可知，质粒没有受到污染，在操作
过程中也没受到污染
二、 从受体菌对照组无菌可知所用细菌中不含质粒。
三、 从实验组图片中可知，在操作过程无杂菌污染，实验比较成功，但是
菌群不多，比较模糊，我觉问题应出现在下列几个方面:
1、 应是在步骤（9）中从EP管中所取的量不足或者只取了上层清液，造成细菌较少；
2、 培养的时间较少，细菌还没有完全的长出来;
3、 大部分大肠杆菌的转化不完全，没有充分表达质粒编码的抗生素抗性基因，造成在培养基上不生长。
