Ion Mate-pair文库构建手册
一、流程图
基因组DNA提取
↓ 基因组定量检测
↓
DNA破碎（Covaris S2）
↓ 末端修复 ↓
文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）
↓ 文库片段定量
↓
MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒）
↓纯化 Qubit定量
↓
确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（根据DNA含量确定是否可
进行下一步）
↓ DNA片段环化
↓
纯化环状DNA（除去非环化DNA）
↓纯化
定量（若起始上样量为1-2ug，则不需要定量）
↓
环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化
↓
T7核酸外切酶、S1核酸酶 酶切
↓磁珠纯化
末端修复 ↓
文库片段于链霉素亲和素微珠相连
↓ 连接Ion接头
↓
缺口修复、预扩增凝胶条带检测（确定循环数）
↓
片段扩增（使用确定的循环数扩增） ↓SOLiD试剂盒纯化
E-Gel胶回收
↓
Agilent检测，Qubit定量
↓ 文库构建完成
二、实验步骤：
第一部分：样品打断及定量 1.样品质控 OD260/280=1.8-2.0 使用1-5 ug gDNA起始 2.DNA片段化处理
使用0.2 ml PCR管，使用LowTE将1ug DNA稀释到200ul，装入0.2的PCR小管中。
按照以下条件将DNA打断成3kb大小的片段： Target BP Intensity Duty Cycle Cycles per Burst Treatment Time（s） Temperature（℃） Sample Volume（ul） 3.末端修复
使用Mate-Paired Library Enzyme Module 按照以下条件配置体系： Compoent Sheared DNA 5×Reaction Buffer 3-kb library <67 uL 20.0 uL 3kb 0.1 20% 1000 600 20 200 10 mM dNTP End Polishing E1 End polishing E2 Nuclease-free Water Total 4.0 uL 4.0 uL 5.0 uL Vareis 100 uL 室温（20-25℃）下放置30min。 将以下体系加入到上述反应体系中： Component 20% SDS 3-kb library 8.5 uL 10× BlueJuice Gel Loading Buffer 10.0 uL 65℃变性处理10min，冰上放置5min后，准备琼脂糖凝胶分离和切胶回收 4.琼脂糖凝胶电泳及切胶回收 准备1%琼脂糖凝胶分离3-kb片段 配置琼脂糖胶 Component 1×TAE Agarose Du-red稀释液 Total Volume 20.0 mL 0.2 g 20 uL 20 mL 使用大孔梳子做成一块分离胶，待胶凝固之后放入电泳槽中，点入Marker和样，120V，80mA电泳20-30min，使用胶回收试剂盒进行切角纯化。 5.样品定量
使用Qubit2.0对纯化后的DNA片段进行定量。
——Stopping Point—— 第二部分：环化 1.计算MP接头加入量：
公式：需要加入MP接头的量（uL）Y=330×
106
DNA含量（ug）
3000
