真核细胞基因组DNA的提取与鉴定
一、目的要求
掌握真核细胞基因组DNA的提取方法，掌握紫外分光光度法测定DNA含量的方法和DNA电泳方法。重点实践植物 DNA 的抽提，掌握 CTAB 法快速抽提白三叶草 DNA 。 二、基本原理
植物 DNA 的抽提常采用两种方法：
（1） SDS 法： 离子去污剂，过程长，纯度高；
（2） CTAB 法：该方法简便、快速，DNA产量高 (纯度稍次，适用于一般分子生物学操作 ) 。CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐 （>0.7mM ） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（ 0.1-0.5mM NaCl ）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA ，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。现生物试剂公司多依据此原理，经过改造，以吸附膜吸附DNA，除去杂质，从而减少了使用有害药品氯仿抽提的步骤。
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，将其熔化在所需缓冲液中使成清澈、透明的溶液，然后倒入胶模令其固化。不同浓度的琼脂糖形成的固体基质具有不同的密度（或孔隙度），因此适宜分离不同大小的DNA片段。在电场中，DNA分子主要因其分子大小不同而被分离。 三、实验步骤（具体见试剂盒操作说明） 植物基因组DNA的提取（参考步骤）
1． 采集适量幼嫩叶片，用液 N2 研成粉末， 0.4 g 装入 1.5ml 离心管中（ -20 ℃预冷）。 2． 预热 1.5 × CTAB 到 95 ℃，加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融）。 3． 立即置于 65 ℃水浴 30min ，每 5 min，上下颠倒 1 次。
4． 12000g 离心 5 min。 5． 吸取上清液约 600μl ，加入等体积（ 600μl ）氯仿 / 异戊醇 (24:1) ，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。
6． 12000g 离心 5 分钟。
7． 取 450μl 上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95% 乙醇和 45μl 10M NH4AC ，混匀，室温放置 10min 。
8． 12000 g 离心 10min ，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥约 30 min 。 9． 加入 50μl 1/10 TE 或无菌水（含 20μg/RNase ），置于 4 ℃过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。 琼脂糖凝胶电泳
1. 琼脂糖凝胶板的制备
配制1%琼脂糖-TAE（242 g Tris，57.1 ml乙酸，100ml 0.5M EDTA pH 8.0，用时稀释50倍）凝胶液。待琼脂糖完全溶解并冷却至65℃左右，小心倒入有机玻璃内槽，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1 h左右，待凝固完全后，将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中待用。 2. 加样
在电泳槽中注入TAE稀释液，没过整个胶面，拔下加样梳。向DNA样品中加入1/10
体积的加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液），充分混匀，用微量加样器将DNA样品加入加样孔中。可在相隔加样孔中加入DNA marker，以估计DNA条带分子量。 3. 电泳
加完样品的凝胶板立即通电，进行电泳，电场强度不高于5 V/cm。当指示剂移动到距离胶板下沿约1-2 cm处，停止电泳。
4. 观察
电泳凝胶用EB（溴乙锭）染色（可提前加入琼脂糖凝胶液中），在波长为254 nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。紫外光激发30秒左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。 四、注意事项：
1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的β -ME 处理 2．研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化
3．实验过程中动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的 4．所用试剂必需灭菌 五、思考：
1. DNA 降解的可能原因 2. 提高DNA产量的措施
附注：
1．影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
① DNA 分子大小 迁移速率 U 与 logN 成反比（ N 为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（ DNA 结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋 > 线性 DNA ）
② 琼脂糖浓度： logU=logU0Krt胶浓度， U 为迁移率，U0为 DNA 的自由电泳迁移率， t 为胶浓度， Kr 为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的 DNA Agarose ： 0.5% ： 1-30 kb ； 0.7% ： 0.8-12 kb 1.2% ： 0.4-7 kb ； 1.5% ： 0.2-3 kb.
③ DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状 > 线状 DNA> 单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB 含量有关。
④ 所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm
⑤ 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 ℃
⑥ 嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率 ( 不提倡加在电泳液中 )
⑦ 电泳缓冲液 （ 0.5 × TBE ）的组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA 变性，一般采用 1 × TAE ， 1 × TBE ， 1 × TPE （均含 EDTA pH 8.0 ）。 2．溴化乙锭（ EB ）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（ Bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴（ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。
