同时设对照，在室内自然温度、湿度及阳光条件下，个一定时间进行花粉生活力测定，比较其差异性。
（三）花粉生活力测定
鉴定花粉生活力的方法有很多，概括起来不外下列几种：一是将待测花粉直接授粉，最后计算结实数和结籽数；二是将花粉授到柱头上，隔一定时间切下柱头，在显微镜下观察花粉萌发情况，测定萌发率；三是形态观察；四是染色观察；五是在人工培养基上播种花粉，观察萌发率。以后三种为主介绍花粉生活力测定的具体方法。
1.形态观察法
一般把具有品种典型性的花粉（指具有该品种花粉粒的大小、形态色泽等）作为具有生活力的花粉，把小型的、皱瘪的、畸形的作为无生活力的花粉。
形态观察的具体方法是：首先将花粉置于载玻片上，在显微镜下查看5个视野，要求被检查的花粉粒总数达100粒以上，计算正常花粉粒占总数的比率。此法简便易行，但准确性差，通常只用于测定新鲜花粉的生活力。
2.染色观察法
（1）碘－碘化钾染色法。先称取0.3g碘和1.3g碘化钾溶于100ml的蒸馏水中，即成碘－碘化钾溶液。取少量花粉振播到用棉球擦净的普通载玻片上，然后加水一滴，使花粉散开，再加一滴碘－碘化钾溶液，盖上盖玻片，置于显微镜下观察不同的5个视野，凡花粉粒被染成蓝色的表示具有生活力，呈黄褐色为缺少生活力的花粉（遇碘变蓝是淀粉的特性）。
（2）氯化三苯基四氮唑（TTC）法。凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用中都有氧化还原作用，而无生活力的花粉则无此反应，因此当TTC渗入有生活力的花粉时其脱氢酶在催化去氢过程中与TTC结合，是污水的TTC变成TTF而成红色。
磷酸盐缓冲液的配置：在100ml的蒸馏水中溶解0.832g的Na2HPO4·2H2O和0.273g的KH2PO4，调整pH值为7.17。
TTC溶液配置：取0.02～0.05g的TTC溶解于10ml磷酸缓冲液中，放于棕色瓶中，置于暗处。取少量花粉于凹玻片的凹槽内或直接放于普通载玻片上，滴入0.5％TTC溶液一两滴，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，将此片置于35～40℃下15～20min，在显微镜下观察不同的5个视野，反被染成红色的均为有生活力的花粉。
（3）?-萘酚法
①配制药液
A.将0.20g联苯胺溶于100ml的50％的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。 B.0.15克?-萘酚溶于100ml的乙醇中，盛入棕色瓶中，放暗处备用。 C.0.25克碳酸钠溶于100ml蒸馏水中，盛入白色瓶中备用。
D.将以上三种溶液等量混合，即成“甲液”，盛如棕色瓶中。
E.将3%过氧化氢，临用前用蒸馏水稀释成0.3%溶液，即成“乙液”，随配随用。
②制片
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取花粉少许，撒入凹型载玻片的凹点内，滴入“甲液”，片刻后在滴入“乙液”，3～5min后，在显微镜下观察不同的5个视野。凡有生活力的花粉为红色或玫瑰红色。黄色的（不着色的），为无生活力的花粉。
3.发芽实验法
此法受花粉萌发的培养基限制。若有适宜的培养基能精确测定出具有生活力并能够萌发的花粉粒的个数，还能看到花粉粒发芽的真实情况。
（1）悬滴液发芽法
把供试花粉播种在一定浓度的培养液液面上，使其花粉真实地发芽，以测定生活力高低的一种方法。培养液一般都是用蔗糖或葡萄糖溶液，浓度因物种而不同，差别很大。糖液浓度高低是为了调节培养基的渗透压，防止供试的花粉在溶液中发生破裂。适合多数园林植物花粉的发芽，通用培养基配方如下：
蔗糖10％加H3BO3100mg/L，Ca（NO3）MgSO4200 mg/L，KNO3100 mg/L，22300mg/L，可配成母液，用时稀释，母液放在冰箱中保存。
具体操作方法：配制10％蔗糖溶液，滴一滴于凹玻片上，取少量花粉置于滴液中，用大头针搅拌均匀，然后将凹玻片放在培养皿加盖放到20-25℃温箱中。加盖2h后花粉即开始萌发，24h后在显微镜下检查发芽花粉的百分率。不同物种的花粉发芽所需的时间不同，如牡丹花粉用15％蔗糖溶液在室温条件下，接种后一小时即可观察 。花粉发芽检查在低倍镜下进行，花粉的长度为花粉粒直径2倍以上才算发芽， 一倍以上者算萌芽。
（2）培养基发芽法
①培养基的制备：在250ml的烧杯中加入90ml蒸馏水，再加入1g的琼脂，在酒精灯上加热，使之完全溶解，然后加入定量蔗糖，制成不同浓度（5%、10%、15%、20%）的蔗糖琼脂培养基（分组加，每组制成一个浓度），为了防止水分蒸发，配制加热的烧杯应加盖。
先把水在酒精灯或电炉上加热煮开，倒入琼脂，使之融化，然后倒入蔗糖，用玻璃棒不断搅拌，呈透明状即可。为保持培养的浓度，可在烧杯上液面处贴上纸条或用玻璃铅笔沿液面划线标记，当液面在熬制过程中因水分蒸发下降时应及时添加蒸馏水，以保持液面的稳定和培养基的标准浓度，并将熬制好的培养基溶液连同烧杯放入盛有35℃热水的容器中，防止冷却凝固，以备随后使用，即配成5%浓度的培养基。同法配成10%、15%、20%浓度的培养基。
②用品消毒：发芽实验时所用的载玻片、凹玻片、镊子等都要在消毒柜中消毒或在100℃条件下煮沸20min，冷却后取出用酒精棉球擦干放在大培养皿中备用，经过消毒过的载玻片使用时要尽量减少和手指接触的面积，以减少污染。
③花粉的播种与检查：用玻璃棒蘸取培养基溶液，立即滴一滴于盖玻片的中央（直径1.5-2.0mm），使成为一表面完整的球面（球面越薄越好，否则透光性差，影响在显微镜下观察），当凝固后再进行花粉的播种。
播种花粉时，用经过酒精消毒过的发丝蘸取花粉（若所用花粉为陈花粉或过于干燥的花粉时，可在播种前取出一部分在湿气大的培养皿中密闭15-30min后
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在行播种），轻轻震动（风媒花）或涂抹（虫媒花）在培养基表面。一要注意发丝不能过重地接触培养基表面，避免破坏培养基的表面；二是要注意花粉的分布要松散、均匀，不能密集成堆，；三要注意适宜的播种数量。经验证明，花粉太稀，影响发芽，播种太稠也影响发芽，一般情况下，一个显微镜视野以分布20-50粒花粉为宜。播好后将盖玻片翻转，置于载玻片上的小玻璃环上，小玻璃环上下涂上凡士林，环内加1第水用于保湿。
湿室密封后，应在载玻片上用玻璃铅笔标号，并进行记录，记录内容包括花粉种类、培养基的糖液浓度、采粉时间，播种时间、湿室中滴水的多少。然后全组集中放在一个大的瓷盘中，用纱布覆盖后加盖，放于15-25℃的温箱内24h后进行检查。如果时间允许，最好播后每隔2-3h检查一次，直至花粉粒发芽数不再增加为止，记载花粉发芽数，以明确不同花粉的发芽的速度和发芽进程。牡丹花粉接种后1h即可观察。花粉发芽检查在低倍镜下进行，花粉的长度为花粉粒直径2倍以上算发芽，一倍以上者算萌芽。每片应观察5个视野花粉数不少于100粒以上，计算发芽率，此法每人做3片，选发芽情况最好的一片进行发芽情况的检查。
五、思考题
1.详细记载花粉采集及贮存的日期、花粉名称、花粉收集方法及过程、花粉贮藏方法。
2.通过实验总结所采集贮藏的花粉种类的特点。 3. 用染色法计算花粉生活力（5个视野）。用发芽法计算花粉生活力（5个视野）。
4.绘一幅花粉粒发芽形态图。 附表
表1 0℃条件下控制各种湿度所需H2SO4的百分比浓度
相对湿度 H2SO4％
0（极干燥） 10 95
63.1
25 54.1
35 48.1
50
65
70 29.4
90 17.8
43.1 34.8
表2几种物质在一定条件下所控制的相对湿度
物质 CaCl2
H2SO4（相对密度1.45） 硅酸
醋酸钾饱和液
温度 0℃ 4℃
保持相对湿度/％ 32 30 5 22
表3花粉生活力测定统计表 测定方法 花粉种类 培养基的采粉播种湿室中滴有生活力的花粉/观察花粉总数 1 2 3 4 5 总计 7
花粉生活力/％ 糖液浓度 时间 时间 水的 多少 碘－碘化
钾染色法 氯化三苯基四氮唑（TTC）法 ?-萘酚 悬滴液发芽法 培养基发芽法
实验三 有性杂交技术
一、目的和要求
园艺植物有性杂交是创造树新类型的主要方法之一，本实验是通过品种间杂交的实际操作，掌握有性杂交技术。
二、材料和用具
材料：葡萄
用具：镊子、小剪刀、纸牌、透明纸袋、授粉器或毛笔、细棉纱线或回形针、干燥器、指形管、棉花、酒精（70%）、红漆。
三、有性杂交技术
葡萄
1．花器结构及开花习性
大多数葡萄的栽培品种是完全花，花很小，着生在复总状花序上（圆锥花序），花冠绿色。上部合生，开花时下部与子房分离，向外卷曲成帽状脱落，雄蕊5～6个。在栽培品种中，除了完全花品种外，还有“雌能花”品种。这种花的雌蕊完好，有正常受精能力，而它的雄蕊花粉通常是不育的，没有受精能力。
葡萄花芽为混合芽，着生在结果母枝的叶腋，枝条的中下部叶腋芽能形成花芽，但以基部3～8节形成的花芽最佳，在结果枝上应选择下部的花序供杂交用。 新梢下部的花序比上部花序开放早。花蕾一般在上午6～11时开放，以9～10时开放最多，一个花序的花期约3～5天，柱头花蕾开放后4～6天内有受精能力。
2．杂交技术
（1）花粉的收集和贮藏
一般收集葡萄花粉是在晴天的早上，采摘刚开而未经昆虫访问过的父本花序，在室内用镊子取下花药，这种方法对花的收集较为经济，但较费事；另一方法是用透明纸袋直接套在未开的父本花序上，待花盛开时，用手多次震动花序，花药，花粉即落至透明纸袋内。
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花粉收集以后，将它们放在吸水能力强的纸上，清除其中的花丝，待花药稍干后，再将它们倒入小瓶或指形管中，用棉花塞好瓶口，贴上注明品种和采收日期的标签，放在干燥器内，置于0℃～10℃的低温条件下保存。
（2）去雄和套袋
供杂交用的花序应选择发育良好，着生位置适中的花序。通常在一个发育充实的结果枝上生长着两个以上的花序，最好选用枝条下部发育良好的花序，除去上部花序。由于葡萄是无限花序，一个花序上的花数一般可达200～1500朵。因此，一穗上开花前后不一致增加了杂交的困难，影响果实发育，所以在选定花序后，一般剪去整个花穗尖的1/4和付穗，每个花序保留100～150个花蕾供杂交用，修剪花序后，当有少数花已开放，要进行疏花疏蕾工作，留下那些大致能在同一天开放的花蕾。疏穗后应随即去雄。最适去雄时间是开花前2～3天，这时花蕾已互相分离而肥大。颜色为黄绿色。花瓣和花盘已完全分离，只用镊子在花蕾的顶端一夹，花瓣和花药即可除去。去雄后，应检查有无遗漏的花蕾或残存的花药，然后套上准备好的透明纸袋，扎紧捆绑在结果枝上。
套袋用的透明纸袋大小一般长26厘米，宽14厘米。
（3）授粉
去雄后2～3天即可进行授粉，这时母本花序的柱头上分泌有大量的粘液，表示子房已能接受花粉，而且给花粉创造了良好的发芽条件，是授粉的最适时机。授粉宜在晴朗无风的上午8～10时进行。
少量花序授粉可用授粉器或毛笔蘸花粉授粉；大量花序进行授粉时可将花粉放在透明纸袋内，套到去雄的花序上，用手指从纸袋外面向花粉集中处弹2～3下，于是花粉便在纸袋中飞扬，约经半分钟，使花粉均匀的落在每朵花的柱头上以后即可取出；也可用小型喷雾器，当手压橡皮球时，将瓶内花粉喷在柱头，授粉后立即套好纸袋挂上标签，标明亲本和授粉日期。
授粉10天后拆除纸袋，将布条扎在授粉花序上，半月后可进行杂交结实情况的检查。
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