动物生物化学实验技术
一、生物大分子的制备技术 二、电泳技术 三、层析技术
四、基因重组技术与分子生物学鉴定技术
一、生物大分子的制备技术
? 1.材料的选择与预处理 ? 2.细胞的破碎 ? 3.提取 ? 4.分离纯化 ? 5.浓缩 ? 6.结晶 ? 7.干燥 ? 8.保存
1.材料的选择与预处理
? 选材的原则:
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含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低、注意动物的生理状态和微生物生长期之间的差异。
动物组织要先剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分，洗去血污等，微生物需将菌体和发酵液分离开。
? 预处理的方法：
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2.细胞的破碎
? 1）机械法
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高速组织捣碎机、匀浆器、研磨器等
反复冻融法、冷热交替法、超声波处理法、加压破碎法
? 2）物理法
? 3）化学及生物化学法
? 自溶法、溶菌酶法、表面活性剂（十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠） ? 无论哪一种方法破碎细胞，均需在一定的稀盐溶液或缓冲溶液中进行
3.提取
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? 提取（抽提）：指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离，是由
固相转入液相或从细胞内生理状态转入外界特定溶液环境的过程
? 1）水溶液提取
? 2）有机溶剂提取
1）水溶液提取
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球状蛋白质的提取一般以水溶液为主，以盐溶液及缓冲液提取蛋白质和酶时常需注意以下几个因素：
? 盐浓度：常用等渗溶液，如0.02-0.05mol/L磷酸盐缓冲液、
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0.15mol/L氯化钠溶液 侧，常为pH3-6。
? pH值：保证蛋白质在稳定的范围内，选择在偏离等电点的两
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? 温度：0-5°C
? 其它：加入保护剂、底物、辅酶等
2）有机溶剂提取
? 一些与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白
质和酶，常用有机溶剂提取，如丁醇提取法（pH3-10，-2 ~40°C）
4.分离纯化
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分离纯化：在抽提的基础上，去除多种同类或异类物质的过程
? 1）盐析法
? 2）有机溶剂沉淀法 ? 3）等点沉淀法 ? 4）选择性变性法 ? 5）吸附法 ? 6）离心沉淀法 ? 7）透析法 ? 8）超滤法 ? 9）酶解法 ? 10）电泳法 ? 11）层析法
1）盐析法
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? 原理：
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盐溶：由于少量离子的作用，减少了偶极溶质分子之间极性基团的静电引力，增 盐析：由于盐浓度增加到一定程度，水的活度被降低，蛋白质表面的大量电荷被
加了溶质和溶剂相互作用力的结果。
中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而沉淀析出。
? 盐的选择：
? 硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等
2）有机溶剂沉淀法
? 原理：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致
溶解度的降低；另一方面，由于溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，导致蛋白质沉淀析出。
? 有机溶剂沉淀法的优缺点：
? 优点：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其它溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓
度范围内才会沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易；在生化制备中的应用比盐析法广。
? 缺点：对某些具有生物活性的大分子，容易引起变性失活，操作常在低温下进行，加入
有机溶剂时注意搅拌以避免局部浓度过大。分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。
3）等点沉淀法
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利用蛋白质在等电点溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离，常和盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用。
4）选择性变性法
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选择一定的条件使其它蛋白质沉淀而又不影响所需蛋白质的分离方法。如将提取液适当加热、用惰性液体氯仿震荡、利用酸碱或加入重金属离子等进行选择变性。
5）吸附法
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吸附目的生物大分子或杂质，常在微酸性条件（pH5-6）及稀盐溶液中进行。
? 洗脱时一般多在弱碱性条件或适当提高洗脱液离子强度，即可将被吸附的生物大分子洗脱下来。吸附操作可用静态吸附，也可用柱层析吸附。
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常用的吸附剂：
? 硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、聚苯乙烯、磷酸钙等。
6）离心沉淀法
? 离心：利用离心机，借助离心力分离液相非均一体系的过程，即进行固液相
分离和不同比重或不同分子量大小的溶质与液体的过程。
? 离心机的分类：
低速（<0.4万r/min）、高速（0.4-1.5万r/min）和超速（1.5-5万r/min） ? 大容量和小容量 ? 常温和低温
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使用离心机的注意事项
? ：
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1.注意防潮、防止过冷和过热，尤其要注意防止腐蚀性试剂的污染
2.使用前应先行检查离心机的安放是否水平和稳定，其次要检查对称位离心管、内容物和套管是否平衡，即重量相差不得超过0.1克，离心管及套管中如有玻璃碎片等，应予及时清除。套管底部必须加以缓冲胶垫，以免离心时离心管破裂。
3.离心时应检查转速器是否位于起点,经检查转速无误后打开开关。启动后速度应缓慢提高。离心完毕后，将转速器缓慢退至起点，关闭开关并任机器自行停转。注意切不可用手施加 外力助停，以免沉淀泛起。
4.使用完毕，及时清除机内水滴及污物
7）透析法
? 透析：透过薄膜除去或添加小分子溶质的过程。可用于生物大分子脱盐、浓
缩及添加小分子溶质。
? 透析袋：透析袋的膜孔有大有小，要根据欲分离的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、
火棉胶膜、硫酸纸膜、蛋白质胶膜等。目前常用的透析膜是由纤维素类物质制成的。
? 透析的操作：
8）超滤法
? 超滤：加压膜分离技术之一，以超滤膜为分离介质，通过对薄膜上的溶液加压过滤，使
小分子物质通过，大分子物质则被截留。这种利用超滤膜分离大分子和小分子物质溶液的方法称为超滤。这一近年来发展起来的新方法最实用于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩和脱盐，并具有成本低、操作方便、条件温和、回收率高、能较好地保持生物大分子的生理活性等优点。超滤法还可用于生物大分子的分离纯化，是目前发展较快且为人们乐于采用的生化技术之一。
? 超滤膜的特点：微孔过滤用的膜平均直径为50nm-14um，用于分离较大颗粒。加压超
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