RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。RIP这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀ChIP技术的类似应用，但由于研究对象是RNA-蛋白复合物而不是DNA-蛋白复合物，RIP实验的优化条件与ChIP实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经RIP实验验证等等）。RIP技术下游结合microarray技术被称为RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的RNA变化。 Millipore基于磁珠的RIP实验流程 RIP 实验基本原理：
1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。 2. 防止非特异性的RNA的结合。
3. 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
4.结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。
延伸阅读：95%的人类基因组并不编码基因，而是产生大量的非编码RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约2%。这些非编码RNA在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用，与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程，因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化。因此，RNA研究也被越来越多的科学家重视起来，目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域，而RIP技术也逐渐成为RNA研究领域的一项常规方法，帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。
RT-qPCR原理
标签： PCR RT-qPCR 相关专题：QPCR
摘要 : 实时RT-PCR应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工程、微生物学和诊断学定量测定mRNA所用的的方法。尽管他被描述成“黄金”标准，但他还远远未达到成为标准检测的程度。由RNA模板
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实时RT-PCR定量测定mRNA
实时RT-PCR应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工程、微生物学和诊断学定量测定mRNA所用的的方法。尽管他被描述成“黄金”标准，但他还远远未达到成为标准检测的程度。由RNA模板的多变性、含量测定的设计和方案造成的很重要的问题，与不恰当的数据标准化和数据分析一样，也是被众人所知却又忽视掉了。标准化的第一步，我们描绘了一系列RT-qPCR草案的基本的技术步骤，要求产生的数据具有可靠性和重演性。我们更愿意强调说，无论如何，RT-qPCR数据只是关于一个细胞或组织给定转录物的量的快速测定的信息。任何可变的mRNA水平的生物结果分析必须包括关于调节RNA、蛋白含量和蛋白活性的附注信息。这里描述的整个试验，包含了最初的含量设计到qPCR数据分析，需要大约15小时。
INTRODUCTION
RT-QPCR包括三部分：①依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA; ②用pcr扩增cDNA;
③实时监测和定量测定cDNA的量
尽管已经选用为定量测定RNA的方法，这种含量测定的安全性依然值得商榷。首要的是以下几点：①结果依赖于模板的量、质量和最佳的方案设计;②逆转录反应不是标准化的，因此，可能多变性高;③数据分析高度主观化，如果操作不恰当含量测定的结果就会混乱。因此，通过质量评估每一个RT-qPCR组分含量和保持数据分析的统一性来降低多变性和扩大重现性是必要的。基因表达测定标准化明确要求，与人类临床诊断分析有显而易见的关系。因此，我们关注这个实验的遍及整个实验指导的质量控制。
THE ASSAY
RT-PCR (qPCR)在单管PCR的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次PCR循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次PCR荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct值越小。当维持PCR分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。闭管(均质)形式消除了扩增后手工操作的需要，显著的减少了手工操作的时间和污染的风险。
Current problems
这种技术的广泛应用造成大量的可定量测定数据的方法的产生，利用①新鲜的、冷冻的或FFPE样品;②整体活组织检查、显微切割、单个细胞、组织培养细胞;③总RNA或mRNA;④一系列不同cDNA引发机制;⑤不同的酶或酶切反应体系;⑥不同效率、灵敏度和活跃的检测⑦多样的检测试剂、反应条件、热循环仪⑧个人的分析方式及报告方法。每一步都明显不具有标准化的检测，在样品处理、对照的使用、数据处理和质量控制处理的不同使这种不标准化进一步加剧，并且与RT-qPCR的可靠性、相关性和重复性有及其密切的关系。
理想的情况是，在每一步引入不确定的实验设计时，要通过比较所有可能的实验方案得出。显然这种方法的并不现实，我们提出一系列基于现在的一些想法试验方案，每一步都包含在内。逐一讨论样品的选择、储存和RNA的提取已经超出了本文的范围，我们将在别处予以介绍。本文从RNA的提取开始。我们相信这些试验方案将为大多数研究人员所接受并且能够产生可靠的数据。在每次试验中，每一个推荐的特定的试验方案的都会经过验证，但是不同的应用可能需要许多修改以适应特定的使用者。RT-qPCR操作和替换步骤的整体考虑如图2所示。
RNA assessment
常用的定量测定RNA的方法有很多，每年选修EMBO qPCR课程的学生一般会比较用Ribogreen、Agilent BioAnalyser、分光光度计、Nanodrop及现在使用更多的BioRad Experion 用以测定相同的RNA样品。结果显示，没有任何两种方法会产生相同的数据，比较用不同方法获得的数据是不明智的。这得出这样一个结论，谨慎的做法是用同一种方法测定所有的样品并加以报道。
RNA quality
RNA质量包含两方面的内容，纯度(无蛋白、无DNA污染、无抑制因子)和完整性。传统意义上RNA质量通过分析其在A260/A280时的比率，和/或分析核糖体RNA在琼脂糖凝胶上的条带以及一个最新的方法Agilent Bioanalyser/BioRad Experion micro?uidic capillary electrophoresis systems。一个近期的报道声称，通过测定Agilent2100一些电泳图谱，包括测定这些区域的18S and 28S RNA片段，28S顶点高度，快速反应区比例和标志高度，并用这些计算每一个RNA样品的完整数(RIN)，可以更加客观的测定RNA的质量。然而，通过RT-qPCR分心操作得出的关于RNA样品完整性的详尽分析却得出不同的结论。作者提出，通过大量的组织样品提取的RNA样品，将他们控制分解并用Agilent Bioanalyser进行分析。这些样品的RIN在10(表面上完整的材料)到4(几乎无法证明是rRNA)之间。这些样品的每一个转录物的质量都会被RT-qPCR验证。在一些组织中检测到的转录物的质量不受RNI的影响，反之，一些具有线性关系或其他具有阈值效应的会受影响。严格来说，对于不同的组织其转录物的质量和RNI值之间的关系是不同的，并且这些因子间并没有可预见的关系。作者推断适度减少RNA样品能够增加分析和定量的可靠性，只要扩增子保持较短的状态(<250bp)并且不受内部影响标准化表达。这两个报道的差异可能是由于RIN和作者提倡的使用RINs的参考基因表达值之间相对较弱的相关系数(0.52)。
由于缺乏一种可选择的可靠地mRNA完整性的测量标准，我们提议用
GAPDH(NM_002046)从3’到5’端对目的基因进行测定。许多年来，获取的数据不依赖于rRNA的完整性，需要提供一个合理的检测目的转录物分解量化标准和规范采用微点阵使用者以及长期来被接受及常用的适用于PCR终点分析的标准方法。对无所不在表达的mRNA完整性从3’到5’端分析测量，已被GAPDH基因特异的证实，它被认为是在一个给定的样品中所有mRNA完整性的代表。然而，因为不同的mRNA降解率不同，这不可能总是作为范例，并且对于特异的目的基因设计相似的试验方案是必要的。1.3 kb GAPDH mRNA的实时反应用oligo-dT作预处理，用单独的多重PCR分析测定，三重目标扩增水平的量。空间分离一个是在mRNA的5’端，第二个在中间，第三个在3’端。扩增比率反映了oligo-dT预处理的实时反应沿着整个始转录物起前进是否成功。明白地说，RT酶从5’端扩增的进行依赖于mRNA的完整性，如果mRNA降解了，酶就无法完成。显然，3’：5’的比率接近1表明其高度完整，反之，任何大于5的比率说明mRNA的分解。这个实验分析用TaqMan 试剂(如：每次扩增由目标特异性差别标记探针进行检测)设计成三重分析。
