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质粒的提取与鉴定实验报告
篇一：质粒DnA测定生化实验报告 生物化学实验报告 姓名：杨晓霞 学号：3120XX0025 专业年级：20XX级口腔 组别：第一实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心 篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定
姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组 质粒DnA的提取、纯化与鉴定
摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关
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因子。
关键词：碱变法质粒电泳 实验目的：
1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。 实验原理：
1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：
提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
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碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。 在细菌细胞中，染色体DnA以双螺旋结构存在，质粒DnA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DnA和质粒DnA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液ph值不同。在ph值高达12.0的碱性溶液中，染色体DnA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DnA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用ph值4.6的KAc(或naAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DnA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DnA不能复性，而是与不稳定的大分子RnA、蛋白质-sDs复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DnA分离。溶于上清的质粒DnA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DnA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DnA与RnA性质类似，乙醇沉淀DnA的同时，也伴随着RnA沉淀，可利用RnaseA将RnA降解。质粒DnA溶液中的RnaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DnA。
姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组 2.凝胶电泳进行DnA分离纯化：
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电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定ph条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DnA片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DnA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidiumbromide，eb)或sYbRgold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DnA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DnA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5—50(:质粒的提取与鉴定实验报告)0bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DnA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DnA序列分析的分子基
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