3 激光散射和细胞化学染色技术
最早采用该技术的是Technicon公司的H1,H3型，现在的最新型为西门子公司的Advia120型和2120型（2007年以前为Bayer公司产品）。他是一款开发比较早的高等级仪器，其在白细胞分类上采用了过氧化酶测定通道和嗜碱粒细胞测定通道。根据细胞化学染色的特性进行白细胞分类。在红细胞和血小板分析都采用了双角度激光法。在仪器的管路、电磁阀门、反应杯上采用了独特设计的集成液流版管路系统，是目前血细胞分析仪中所独有和特有的技术。
集成液流板实际上是将各种管路和电磁阀门、反应杯等血球计数仪的常用硬件进行综合处理，系统化，微小化，透明化和集成化。形成的集成板被放置在仪器的明显部位，方便观察，并具一定的美观效果。其另一特点则是细小的管路和反应杯可是标本和试剂用量明显减少。
图6 Advia 120的集成液流板。
在白细胞分类上，该仪器采用两个通道进行，一个为过氧化酶检测通道，另一个为嗜碱细胞检测通道。 过氧化酶反应（peroxidase，POX）是血涂片染色的一个常用细胞化学染色方法，用于鉴别原始细胞与成熟的粒细胞，鉴别粒细胞与非粒细胞。染色后的细胞内无蓝黑色颗粒出现为阴性反应，出现细小颗粒或稀疏样分布的黑色颗粒为弱阳性反应，出现黑色粗大而密集的颗粒为强阳性反应。过氧化物酶主要存在于粒细胞系和单核细胞系中，各类白细胞对过氧化物酶的反应是这样的：早期的原始粒细胞为阴性，早幼粒以后的各阶段都含有过氧化物酶，并随着细胞的成熟过氧化酶含量逐渐增强，中性分叶核粒细胞会出现强阳性反应，嗜酸性粒细胞具有最强的过氧化物酶反应，嗜碱粒细胞不含此酶呈阴性反应。在单核细胞系统，除早期原始阶段外，
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幼稚单核和单核细胞会出现较弱的过氧化物酶反应。淋巴细胞、幼稚红细胞、巨核细胞等都为过氧化物酶阴性反应。Advia 120/2120血细胞分析仪的过氧化酶（Perox）检测通道就是根据这个原理设计的，它检测每一个通过流动计数池中的白细胞，经过激光照射所产生的过氧化酶散射光吸收率，来当然试剂和辅助试剂均进行了改良。
在Perox通道所产生的散点图，横轴表示在5°-15°激光散射获得的细胞过氧化物酶含量情况，纵轴是低角度散射光测量的细胞体积大小。在此通道内细胞被分为五类。1）过氧化酶最强阳性的嗜酸性粒细胞；2）过氧化酶强阳性的嗜中性分叶核粒细胞；3）体积较大、过氧化酶弱阳性的单核细胞；4）体积较小、过氧化物酶阴性的淋巴细胞；5)体积大于淋巴细胞且过氧化物酶阴性的未染色大细胞，此类细胞增加提示幼稚或原始的各类细胞可能出现。
在嗜碱细胞（Baso）通道中采用的检测原理是：专用的嗜碱细胞试剂（Baso）将除了嗜碱细胞以外的白细胞除去细胞膜，使其裸核化并体积变小，仅将嗜碱性粒细胞保持原有状态，体积明显大于其他类的白细胞。在散点图上处于上面区域的为嗜碱性粒细胞；散点图的横坐标可表示细胞核结构的复杂性，处于左侧的为单个核的细胞群，包括单核细胞和淋巴细胞；处于右侧的为分叶核细胞；中间部位则考虑为杆状核细胞；左下端为单个核的原始细胞区。
图7：ADVIA 120/2120仪器Perox通道和Baso通道散点图
该仪器在红细胞、血小板的测定上也采用了光学检测技术。通过激光照射扫描每个通过Flowcell的红细胞，低角度散射光（2 °~3 °）用于测量细胞体积；高角度(5°～15°)散射光测量每个红细胞内的血红蛋白浓度（CH）和血红蛋白含量平均值CHCM。这两个值不受红细胞数量和血红蛋白测定的影响。还可根据每个红细胞内血红蛋白浓度，计算出红细胞内血红蛋白分布宽度（HDW）值。其根据红细胞在体积大小和单个红细胞内血红蛋白含量的分析，将红细胞划分为9个区域，得到红细胞体积和色素含量分布的九分图，也是该仪器在红细胞分析方面独有的特色，根据红细胞分布情况可初步判断疾病类别（下图中）。在血小板计数分析上也同样采用了二维光散射分析法，即可获得血小板体积大小，可测量1~60fl内的各种大小不同的血小板，还可对血小板内容物含量（MPC）进行测定。血红蛋白测定采用连续流动比色法和红细胞散射光直接测定法两种方法，有助于高脂血和高胆红素血标本的血红蛋白测定准确性。
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图8：ADVIA 120/2120 红细胞散点图（左）和血小板散点图（右） 4 双鞘流技术和细胞化学染色法
ABX是法国生成血细胞分析仪器的著名厂家，其生产的全自动血细胞分析仪Pentra 120型为其高端产品。在白细胞分类上采用该公司特有的专利技术-双鞘流（DHSS）分析法。双鞘流是专利技术，而测定本身是通过电阻抗和光吸收法双重原理。标本首先在第一鞘流液中经过电阻抗测定分析，得到细胞体积测定结果，然后通过第二鞘流引导再行光吸收率分析，对细胞内容物进行测定，最终将细胞测定信息在散射图相应的位置表现出来。双鞘流技术的核心部件是含有红宝石小孔的复杂的鞘流池，在双鞘流系统的上下两端分别加上恒定电流，是保证电阻法的测量要素。为了保证被检测的细胞能够正确通过计数孔和鞘流通道，需要利用外来鞘流来进行矫正，因此通过左侧鞘流泵注入稀释液形成第一鞘流液，其作用是保护溶液能够直接通过计数小孔，并且保证其中携带的细胞处于中心部位，液流不发生偏移和扭曲；溶液通过计数小孔后，再通过中间鞘流泵注入稀释液形成第二股鞘流，用以保证吸光度测量。这样的过程被称为双鞘流分析技术。
图9 双鞘流技术示意图
仪器通过两个通道来完成白细胞的五项分类。其采用的细胞化学染色技术（Cytochemistry）的原理是经典的细胞分类技术，此染色剂中含有溶血素及氯唑黑活体染料（Chlorazol Black E）。在仪器的LMNE检测池中，全血样品与染色剂充分混匀，在35℃条件下进行孵育，此过程的作用是：① 溶解红细胞 ②对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗
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粒膜）也进行不同程度的着色 ③ 固定细胞的形态，使其保持自然状态。由于淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同、每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生了特定的吸光率。
染色后的标本被引导进入鞘流池进行双鞘流分析，首先经过60mm红宝石小孔进行电阻法分析，用于判断细胞体积大小，在LMNE散点图上的横坐标即可表示出细胞大小的特性。然后样本迅速进入直径为42mm的第二鞘流检测通道进行光吸收率测定，以判断细胞形态和内容物等情况。根据每类细胞在这两个分析参数上所表现出来的特性，形成二维分布的散点图。在此通道内可完成白细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞群的分类。此通道内在分析的同时还能够检测两群异常白细胞亚群：巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值，异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值，同时还可提供多达82种提示和报警信息。
在LMNE散点图上，各类白细胞的特点是：①淋巴细胞：典型的淋巴细胞体积较小、形态规则、胞浆内没有颗粒，其吸光率最低，所以定位在散点图的右下部矩阵中，正常淋巴细胞散点图为正态体积分布。②单核细胞：典型的单核细胞体积较大、肾状核、胞浆内有初级颗粒（几乎不着色），细胞核大且不分叶，光散射较少，所以位于吸光率轴的最下端，依据单核细胞的体积，位于体积轴的最右端，而异常单核细胞及特大单核细胞则可能出现在LIC的矩阵中。③中性粒细胞：典型的中性粒细胞具有嗜中性颗粒及分叶核的结构，中性颗粒部分着色，同时由于颗粒及核的分叶等形态上的复杂性，而产生光散射。所以中性粒细胞群散点图位于中部。核分叶越多的中性粒细胞，吸光性越强，在散点图上的位置向右移。同时杆状细胞（Bands）体积与中性粒细胞接近，但核的复杂程度低，吸光率低，散点图位于中性粒细胞与单核细胞之间。④嗜酸性粒细胞：由于嗜酸性粒细胞含有特异性颗粒，与染色液特异性着色，其着色强度最深，位于Y-轴的最上端，此方法提高了嗜酸性粒细胞的分类的准确性。⑤巨大未成熟细胞（Large Immature Cell）：未成熟粒细胞因其体积较大，可含有颗粒，光散射强，位于嗜中性粒细胞散点图的右侧，在LIC矩阵图中从左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒细胞，另外各种原始细胞位于单核细胞的右侧区域中。由于此散点图中可能有大单核细胞，可引起LIC假性计数增加（LIC的计数结果被计算到在嗜中性粒细胞中）。LIC包括：大单核细胞、高嗜碱性的单核细胞、巨大中性粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、原始细胞。⑥异型淋巴细胞(Atypical Lymphs)：在散点图中位于淋巴细胞与单核细胞之间的一群细胞，包括：小原始粒细胞、大淋巴细胞等。
在WBC/BASO检测池中，全血样品与BasolyseII（PH2.4）溶血素混合，在35°C恒温下，溶解红细胞，由于嗜碱性粒细胞具有抗酸性，能够保持形态完整，而其他白细胞胞浆溢出，成为裸核状态。细胞通过一个直径为80mm的鞘流微孔时，根据电阻抗原理进行测定，以细胞体积大小为横坐标绘制WBC/BASO直方图。依据阈值设定区分裸核化的白细胞与嗜碱性粒细胞。在直方图上可以看出在中心界标左侧的是细胞体积变小的其它细胞群，界标右侧是体积较大的嗜碱性粒细胞。因嗜碱性粒细胞数量极少，因此在直方图上基本见不到明显分布曲线和峰。
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