土壤中微生物的分离
作者：李洪斌
长沙环保学院 资环1232第三实验小组
【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。
【前言】 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。群落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。
一、实验目的
1..学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数量和组成。 2初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件．所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，对发掘土壤微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。
三、实验器材
(—)培养基：
肉膏蛋白胨琼脂培养基（培养细菌）、 高氏一号琼脂培养基（培养放线菌） 、查氏培养基（培养霉菌） 。
（二）灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培养皿。 （三）土壤样品、天平、称旦纸。 （四）恒温箱、气体流量计
四、试验程序
1、倒平板
将培养基加热融化，待冷至55—60℃时，混合均匀后倒平板；
2、制备土壤稀释液 准确称取土样10g，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装
有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液。
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3、涂布
将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，更换稀释度时需将玻璃涂棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换涂棒。
4、培养
在28℃条件下倒置培养3—5天。
5、挑菌落
将培养后生长出的单个菌落分别挑取少量细胞划线接种到平板上。28℃条件下培养3—5天后，再次挑单菌落划线并培养，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，如果发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，直到获得纯培养。
5.1菌落计数方法
先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片菌苔生长时，则不应使用，而应以无片状菌苔生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全部平皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
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首先选择平均菌落数为30～300的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数即为该样品中的微生物总数。
若有两个稀释度的平均菌落数为30～300，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数:
若大于2，则取其中较少的菌落总数。
若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。
五、实验结果与讨论
总结 ：
实验通过微生物的分离与纯化技术从土壤中分离微生物，经分离纯化培养后用革兰氏染色观察所得菌种。通过对实验的总结，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基一直没能长出菌种，而其他组的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基则能长出菌种，考虑到土壤的来源都是一样的，可以判断牛肉膏蛋白胨琼脂培养基被污染。马铃薯蔗糖培养基经过24h的培养后长出了大量细菌菌落，而经过培养2d后长出了霉菌，由于先前长了大量细菌导致霉菌菌落少，挑取细菌与霉菌纯化培养。马铃薯葡萄糖培养基经过24h培养后长出菌落，判断为酵母菌，经过纯化培养后用革兰氏染色观察。高氏一号培养基经过5d培养没能长出放线菌，但有少量细菌。 思考：
平板培养时为什么要把培养皿倒置？ 答：1.防止皿盖上的冷凝水污染培养基。
2. 防止培养基水分蒸过快发，培养基变干，无机盐析出，营养成分浓度变大，不利于微生物的生长。
六、 注意事项
1.制备混合液平板时，不要再注入培养基前让链霉素液与土壤稀释液相混。
2.制备混合液平板时，倾注的培养基温度不能太高，过高的温度会烫死微生物。 【参考文献】 《环境微生物》（第二版）主编 周凤霞 白京生 化学工业出版社
《伯杰式系统细菌手册》1997年第八版、1986年第九版，主编 布瑞得（美） 《土壤微生物基础知识》作者 西尾道德 北京农业大学出版社 《食品微生物》 朱乐敏 主编
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