糖含量成正比关系，在620nm波长下可测定其光密度值。 (2) 3,5-二硝基水杨酸：
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。 (3)费林试剂滴定法
费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲液（硫酸铜）与乙液（氢氧化钠）生成天蓝色沉淀，在碱性溶液中，乙液（酒石酸钾钠）使氢氧化铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性加热条件下，可以定量还原费林试剂中Cu2+为Cu1+ ,使费林试剂脱色，其脱色的程度与还原糖含量成正比关系。 四、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 ：苹果 2．仪器：（1）恒温水浴锅 （2）Spc22-可见分光光度计（3）容量瓶（4）漏斗（5）研钵 3．试剂：（1）铜试剂：CuSO4、酒石酸钾钠、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3 （2）砷钼酸试剂：（NH4)6Mo7O24·4H2O、Na2HAso4·7H2O；（3）200μg/mL葡萄糖标准液 五、实验步骤
1、制作标准曲线: 取7支试管，按下表操作，然后以标准葡萄糖含量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 管号 0(参比) 1 2 3 4 5 还原糖提取液 葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.2ml 蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 1.8ml 砷钼酸（ml） 2 沸水浴 20min 冷却 铜试剂（ml） 2 OD620nm 葡萄糖含量 （μg） 0 10 20 30 40 50 χ 2、还原糖的提取
称取0.5g葡萄于研钵中→加约30ml蒸馏水由漏斗冲入50ml容量瓶，摇匀→80℃水浴浸提30min→冷却→加3mlZnSO4→加3ml0.3N的Ba(OH)2→振荡后静置→上层出现清夜后再加一滴Ba(OH)2至无白色沉淀→定容至50ml。 3、还原糖含量的测定
过滤提取液→取滤液0.5ml于50ml容量瓶中→定容→取稀释液2ml于试管中→加铜试剂2ml→煮沸10min→加砷钼酸试剂2ml→振荡2min→转入10ml容量瓶→定容→620nm下比色测定→记录结果→查标准曲线。
六、结果与计算
在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量 X×稀释倍数×提取液总体积×100％ 还原糖（%）= W×106 七、思考题
1、何谓还原糖？
2、简述四种常用的还原糖含量测定的原理。 （1）蒽酮比色法；（2）砷钼酸比色法；（3）费林试剂滴定法；（4）3,5-二硝基水杨酸比色法
实验十四 糖的薄层层析
一、实验目的
1、 掌握吸附—分配层析的原理。
2、 了解薄层层析的一般操作及定性鉴定方法。 二、实验原理
薄层层析的原理与一般层析法大致相同，它是固定相支持物均匀地铺在玻璃片上成为薄层，然后把要分析的样品点加到薄层的一端，用合适的溶剂展开而达到分离的目的。按照不同的样品和不同的分离要求可选用不同的支持物，如硅胶G、硅藻土、氧化铝G、纤维素粉、纤维素衍生物等。薄层层析的优点是设备简单，操作容易，分离迅速，需样量少，灵敏度高，分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，其分辨率较高。
本实验学习一种以硅胶G为支持物的糖的薄层层析。在铺有吸附剂的薄层上，样品经过连续反复的被吸附剂吸附及展开剂解吸附的过程后，不同的糖因其分子量不同，羟基数目及醛基、酮基性质的差异，故而在薄层上以不同速度移动而得以分离。被吸附剂吸附强及被展开剂解吸附弱的在薄层上移动速度慢，展开距离短；反之则移动速度快，展开距离长，于是混合糖液中的各种糖就被分离开来。糖在薄板上的移动速度是戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。
在相同条件下，对照已知糖的Rf值可对未知糖进行定性。 三、实验材料、仪器和试剂
1．实验材料和仪器：载玻片、研钵、天平、电热烘箱、电吹风、毛细管、层析缸、喷雾器。 3. 试剂
1、1%标准糖溶液：称取木糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖各100mg ,分别用75%乙醇定容至10ml。 2、混合糖溶液：称取木糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖各1g溶于50ml蒸馏水。
3、糖显色剂：称取1g二苯胺，加入1 ml苯胺。待溶解后加入50ml丙酮，最后加入5 ml H3PO4，边滴加边搅拌。此溶液应透明、无浑浊。
4、展开剂：用前配制。
(1) 正丁醇︰乙酸乙酯︰异丙醇︰冰乙酸︰水=2︰6︰6︰4︰1（V/V） (2) 氯仿︰甲醇=60︰40（V/V） 5、0.02 mol/L 醋酸钠。 四、实验步骤
1、 薄板制备：称取硅胶G 1.5g于研钵中，加入0.02mol/L醋酸钠（含羧甲基纤维素）4.5 ml，研调成均匀糊状后，立即倾于载玻板上，使糊状物迅速铺平，布满整块玻板。将硅胶G薄层在室温下完全固结后置于100℃烘箱中1h，取出置干燥器中备用。
2、 点样：用毛细管分别吸取3种标准糖溶液及其混合液，在距玻板一段1.5cm处，间距1cm分别点样，用电吹风吹干样点。
3、 展开：先在层析缸中放入展开剂，将层析板有样品一段接触展开剂，使其展开，但不可使样点浸没于展开剂中。薄板在层析缸中呈约30度倾斜，密闭层析缸。待展开剂前沿距离板的末端约1cm处时，将板取出用电吹风吹干薄层。
4、 显色：向薄层喷雾糖显色剂，再用电热吹风机吹（或置于80~100℃烘箱烘烤约3~5min）至色斑出现为止。
5、 Rf计算：分别测量溶剂前沿至原点中心的距离，以及各色斑中心至原点中心的距离，计算各标准糖及混合糖中各组分斑点的Rf值，以鉴定混合糖中糖的组分。
Rf值=
色斑中心点至点样点中心的距离 溶剂前沿至点样点中心的距离 五、注意事项
1、 制板时糊状物稀稠合适，铺板迅速，以保证薄板薄而均匀，表面平整。 2、 样品不宜过浓或过稀。
3、 点样点直径≤3mm，样点间距离≥1cm。
4、 用0.02mol/L 醋酸钠（也可用0.02mol/L硼酸）代替水来调制硅胶板，可使Rf值较接近的糖得到更好的分离。
六、思考题：显色时，是否可以采用其他的糖显色剂？
实验十五 植物叶片过氧化脂质含量的变化
一、实验目的：
学习和掌握丙二醛法测定植物叶片中过氧化脂质含量的原理和方法。 二、实验原理:
1、膜脂过氧化作用：
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，细胞中产生超氧阴离子自由基和羟基自由基，诱导膜质中的不饱和脂肪酸发生膜脂过氧化作用，产生脂质自由基。其不仅可诱发脂质进一步过氧化作用，而且又可使蛋白质脱H+而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合，细胞膜变性，细胞损伤或死亡。 2、丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标 ：
膜脂过氧化作用中，产生丙二醛（ MDA ），其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。
在酸性和高温条件下， MDA可以与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮），其最大吸收波长在532nm。 +
H
O2
O O O O H H 3、可溶性糖的干扰：
测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：三叶草
2、仪器: 离心机，天平，试管，研钵，容量瓶，Spc22-可见分光光度计等。 3、试剂：
20%三氯乙酸（TCA）；
0.5%硫代巴比妥酸(TBA)(先加少量的氢氧化钠（1mol/L）溶解，再用20％的三氯乙酸定容)。 四、实验步骤：
1、取三叶草0.5g ，洗净、凉干，剪碎置于研钵中，加少量石英砂和2ml水，研成匀浆，转移到试管，再用3ml水分两次洗研钵，合并提取液。
2、在提取液中加入5ml 0.5%的硫代巴比妥酸溶液，摇匀。
3、用试管夹夹住试管置于沸水中加热10分钟(自有小气泡产生后计时)，冷却至室温。 4、冷却后，离心15分钟（3500r/min），取上清液量其体积（N），以一定量的0.5%的硫代巴比妥酸为空白对照，分别测出其在450nm 、 532nm和600nm下的OD值。 五、结果与计算：
MDA的浓度 C(μmol/L) =6.45(A532-A600)-0.56A450 过氧化脂质MDA含量(μmol/g)=C×V×10-3/W 六、思考题
哪些因素影响膜的完整程度？
试说明膜的完整程度与细胞衰老的关系。
·
· ·
