三、实验材料、仪器和试剂
1、实验材料： (1)大豆粉 (2)脲液
2、仪器: 离心机，天平，试管，容量瓶，可见分光光度计等。
3、试剂： (1)不同浓度的脲液：用0.1mol/L的脲稀释至相应浓度。 (2)奈氏试剂：含有大量汞盐的强碱性溶液，具腐蚀性的剧毒试剂。 (3)0.005 1mol/L的硫酸铵标准溶液 (4)30%乙醇溶液等。 四、实验步骤
1、脲酶提取液的制备：
(1)称取1g 的人造沸石，放在小烧杯中用2%乙酸洗2次，每次约用10ml，再用蒸馏水冲洗至中性。 (2)在锥形瓶内加2g大豆粉，1g处理好的人造沸石(除去溶液中的游离氨)和20ml30%的乙醇溶液,在冰浴中连续摇动15-20分钟。
(3) 以2000转/分钟离心3分钟，取上清备用。 2、脲酶促反应初速度的测定 (1)脲液的准备 试管 1 试剂 脲液浓度(mol/L) 脲液加入量(mL) 磷酸盐缓冲液(pH7) 1/20 0.5 2.0 1/30 0.5 2.0 1/40 0.5 2.0 1/50 0.5 2.0 1/50 0.5 2.0 2 3 4 5 37℃水浴5min
(2) 于上述试管中，加入相应处理的脲酶提取液： 试管 试剂 脲酶提取液（ml） 沸水浴5min的脲酶提取液（ml） 37℃水浴10min，准确计时。
(3) 终止上述各试管中的酶促反应： 试管 试剂 10％ZnSO4（ml） 蒸馏水(ml) 0.5mol/LNaOH（ml） 0.5 10 0.5 0.5 10 0.5 0.5 10 0.5 0.5 10 0.5 0.5 10 0.5 1 2 3 4 5 0.5 － 0.5 － 0.5 － 0.5 － － 0.5 1 2 3 4 5 摇匀，静置5min后过滤或4000r/min离心3min。
(4)NH4+和奈氏试剂反应：另取5支试管，与上述试管对应，按下表加入试剂： 试管 试剂（ml） 滤液 蒸馏水 10%酒石酸钾钠 0.5mol/LNaOH 奈氏试剂 1 1.0 4.8 0.5 0.5 1.0 2 1.0 4.8 0.5 0.5 1.0 3 1.0 4.8 0.5 0.5 1.0 4 1.0 4.8 0.5 0.5 1.0 5 1.0 4.8 0.5 0.5 1.0 迅速混匀(防止氨挥发)，然后在波长460nm比色。
3、标准曲线的绘制 试管 试剂（ml） 0.005mol/L(NH4)2SO4 蒸馏水 10%酒石酸钾钠 0.5mol/LNaOH 奈氏试剂 0 5.8 0.5 0.5 1.0 0.1 5.7 0.5 0.5 1.0 0.2 5.6 0.5 0.5 1.0 0.3 5.5 0.5 0.5 1.0 0.4 5.4 0.5 0.5 1.0 0.5 5.3 0.5 0.5 1.0 1 2 3 4 5 6 迅速混匀，然后在波长460nm比色。以NH4+的摩尔浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线。 五、结果分析
通过标准曲线，计算脲酶作用于不同浓度脲液生成的铵的摩尔数，然后以单位时间内产生的铵的摩尔数的倒数即1/v为纵坐标，以对应的脲液浓度的倒数即1/s为横坐标，作双倒数图，求Km值。 六、思考题
简述本实验的注意事项。
实验十二 过氧化物酶（POD）活性的测定
一、实验目的
通过本实验学习并掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。 二、实验原理
过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其吸光度，即可求出该酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂
1.材料：水稻根系、三叶草叶片、马铃薯块茎等。 2.仪器
（1）分光光度计（2）移液管（3）离心机（4）秒表（5）研钵（6）天平 3.试剂
（1）0.05M磷酸缓冲液（pH5.5） （2）0.05M愈创木酚（3）2%过氧化氢 四、操作步骤
1．酶液提取：取三叶草叶片0.5g，置于研钵中，加2mL磷酸缓冲液，研磨成匀浆，4000r/min离心10min，倾出上清液，残渣再用5mL缓冲液提取一次，合并两次上清液，上清液并入25ml容量瓶中，保存在冰箱（或冷处）备用。
过氧化物酶活性的测定 编号 CK 测定管 0.05M磷酸 缓冲液（ml） 2.9 2.9 2%H2O2 0.05M愈创木酚 (ml) 溶液(ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 酶液(ml) 0.1 0.1 沸水浴 5min 37℃水浴 10min 沸水浴 5min 冷却 OD470nm 调零 ? 五、结果计算
以每分钟光密度变化（以每分钟OD470nm变化0.01为1个活力单位）表示酶活性大小，即 △OD470nm
过氧化物酶活力(U) = ×D
0．01×T 六、注意事项
酶的提取纯化需在低温下进行。 七、思考题
1．试述酶活力的定义？
2．测定酶的活力要注意控制哪些条件？
实验十三 还原糖的测定——砷钼酸比色法
一、糖
1. 糖的生理功能
(1)分布广泛的有机化合物,它是某些植物种子、根、茎的重要组成部分，也是蔬菜、水果等的重要组成部分。
(2)维持生命活动的主要能量来源。
(3)是许多植物和微生物细胞壁的重要组成部分。 2.测定的意义
(1)在植物组织中，糖含量可高达80%左右，在动物和人组织中，含量教少，约为干重的2%。 (2)植物中糖的种类和含量分析，对于选种及控制培育条件有重要的意义。 (3)在微生物发酵中控制培养基中糖等物质的含量，对指导生产实践很重要。 (4)在医学方面根据血糖或尿糖含量的高低诊断某些疾病。 3.测定的方法
(1)根据糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物理性质，可用折射仪、波美比重计、旋光仪来测定糖含量。 (2)根据糖的化学性质可用滴定法、比色法定量测定，此外还有氧电极、酶电极等快速微量的定糖方法。 二、实验目的
1.了解还原糖的生理意义及作用。
2.掌握砷钼酸比色法测定还原糖的基本原理和操作方法。 三、实验原理
还原糖：指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。
对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量以葡萄糖含量计）。 1、砷钼酸比色原理
（1）还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，即产生砖红色地氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：
（2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖地含量（即被还原的Cu2O）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。
2、测定还原糖其它方法 (1)蒽酮比色法：
强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，其颜色的深浅与
