实验三 细胞色素C的制备和含量测定
一、实验目的：
1、通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质样品的一般原理和步骤。 2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测定方法。
二、 原理：
细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochrome c，CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。
细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，每个细胞色素C分子含有一个血红素和一条多肽链。分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。
细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜猪心为材料提取制备和纯化细胞色素C，得到其粗品溶液，方法简单易操作。
三、试验材料和方法
1、材料： 新鲜（冷冻）猪心样品。 2、试剂
（1）25%(NH4)2SO4，12oCl2， 联二亚硫酸钠。
（2）人造沸石：白色颗粒，不溶于水，溶于酸。选用60-80目。
（3）20% 三氯乙酸（TCA）、 1 mol/L H2SO4（55.5ml/L）、 1mol/L NH4OH（67.6ml/L）溶液、 0.2% NaCl、细胞色素C标准液（1mg/ml）、1%AgNO3。
3、仪器： 绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、透析袋等
四、实验方法：
1、材料处理
新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。 2、细胞色素C粗品制备 （1）提取：
称取猪心碎肉200克，加自来水300毫升酸化水（水预先用6~8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调PH=4.0（需要不断调整），搅拌提取1.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液。 （2）中和：
用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20~30分钟，使沉淀沉下。虹吸上部清夜，过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清液，测量体积。 （3）吸附：
每人称取人造沸石4g，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。向柱内加去离子水至1/2体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。
将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度不超过10ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。
（4）洗脱
吸附完毕，可在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在15ml左右）。洗脱完毕，人造沸石回收，可再生使用。 （5）盐析
为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45%（约相当于67%的饱和度，即100ml洗脱液加17g硫酸铵），放置过夜，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。 （6）TCA 沉淀
按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。 （7）透析
溶解液装入透析袋对自来水（30min）、去离子水（10~20min）透析（用磁力搅拌器搅拌），用BaCL2 检测袋周围水的（用试管收集流下来的透析液约1ml，滴加1-2滴BaCL2试剂至试管中。摇匀若无白色沉淀，表示透析完全）。过滤除去不溶物质，得到细胞色素C的粗品液，量体积，测定其含量。 3、 细胞色素C粗品液质量浓度测定（标准管法） 取5支试管按表加入试剂测定： 试管编号 标准液（ml） 样品液（ml） dH2O 还原粉 A520nm 1 0 0 3.0 细胞色素C粗品质量浓度（mg/ml）= 粗品A520nm×C标准×V标准标准溶液A520nm×V粗品 2 0.5 0 2.5 3 0.5 0 2.5 4 0 0.5 2.5 5 0 0.5 2.5 少许（约3mg） 少许（约3mg） 少许（约3mg） 少许（约3mg） 少许（约3mg） 思考题： 1、还有那些方法可以进行蛋白质脱盐处理？ 2、细胞色素C的提取注意事项有哪些？ 注意事项：
1、酸水提取时，由于组织液的释出使pH上升，因此需不断调整pH直至稳定在pH3.5-4.0。 2、为使细胞色素C充分被沸石柱吸附，吸附时流速应该慢些。洗脱时同样控制流速慢些，使细胞色素C在比较少体积内被充分洗脱出来。
3、盐析时需加入粉末状硫酸铵，并且边加边搅拌，切忌一下子到进去，造成局部浓度过大使细胞色素C被盐析。
4、三氯乙酸是一种蛋白变性剂，可使蛋白质变性沉淀。要通过控制三氯乙酸的浓度和作用时间，使其产生的是可逆沉淀，达到进一步纯化作用。因此必须要逐滴加入三氯乙酸，搅匀后尽快离心，避免局部酸浓度过大和接触时间过长，产生细胞色素C不可逆变性沉淀造成损失。
5、透析脱盐是利用细胞色素C分子较大，不能通过一定截留值的半透膜，而其中的盐分由于分子较小，浓度很高，容易透过半透膜从高浓度向低浓度的水相移动，达到去除效果。并且在透析前一定要检查透析袋有无渗漏
6、为尽量减少损失，在每个操作过程都要细心，例如过滤用的纱布、滤纸事前一定要用少量水润湿。 7、加入过多还原粉（联二亚硫酸钠）会使测定溶液迅速变混浊而无法比色，因此加入量应严格控制，并迅速比色。
实验四 魔芋多糖的提取、含量测定及成分分析
一 实验目的
1、了解和掌握魔芋多糖的提取方法。
2、掌握3，5-二硝基水杨酸比色测定魔芋葡甘糖的含量。 3、学习薄层层析原理和硅胶G吸附层析技术。 二、实验原理
魔芋（Amorphophallus konjac）又称磨芋、鬼芋等，是一种天南星科多年生草本植物。魔芋块茎中富含有葡萄糖和甘露糖结合的多聚糖，简称葡甘聚糖（konjac glucomanan,KGM）.它是葡萄糖和甘露糖按不同比例,以β-（1→4）糖苷键和β-（1→3）糖苷键形式连接起来的高分子多糖,相对分子质量(Mr)可达106。
魔芋多糖易溶于水,不溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。魔芋粉经过多次50%乙醇溶液浸提处理后获得魔芋
精粉，其主要成分为葡甘聚糖，其次还有淀粉、纤维素、蛋白质、还原糖等。为了避免这些杂质对葡甘聚糖含量测定的干扰，在魔芋多糖酸水解前应用乙醇反复浸提和多次水洗，以除去游离还原糖、淀粉等。 魔芋多糖经水解后成为单糖：葡萄糖和甘露糖，这些单糖具有还原性，因此可采用还原糖测定方法检测魔芋多糖含量。还原糖测定方法有费林法、蒽酮法和3，5-二硝基水杨酸法（DNS）等。本实验采用3，5-二硝基水杨酸法。 3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物。
3,5-二硝基水杨酸(DNS)
色就可以测定样品的含糖量。
3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色,A550)
在一定范围内，还原糖的含量和反应液的颜色深浅成正比例关系。利用比色法选择波长550nm进行比硅胶G薄层层析是以硅胶G为吸附剂的一种吸附层析。它是利用吸附剂在各种溶剂中对不同化合物的吸附能力的强弱不同进行分离。将硅胶G均匀地涂布在玻璃板上制成薄层板，将欲分离的糖溶液样品点在薄层板的一端，在密闭容器内利用适当的展开剂进行展层，借助于薄层板中的毛细孔的吸附作用，展开剂向上渗透。
三、试剂和器材
1、实验材料：魔芋粉。 2、试剂： （1）、费林试剂：
试剂A：将34.5g硫酸铜溶于500ml去离子水中。
试剂B：125gNaOH+137g酒石酸钾钠→ 500ml去离子水中。 临用时将试剂A、B等量混合。
（2）、碘-碘化钾溶液：称1g KI→100ml水中+0.5g碘，加热溶解即得红色清亮溶液。 （3)、铜试剂：A 4%CuSO4?5H2O；
B 称取24克无水碳酸钠，用850ml水溶于大烧杯，加12克含4分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（应加热）后加入碳酸氢钠16克，再加入120克无水硫酸钠（加热），全溶及冷却后加水至900ml，沉淀1-2天，取上清夜,即可备用。使用前按A:B=1:9混匀,即可使用 (4)、砷钼酸试剂：
25克钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]溶于450ml蒸馏水中（加热溶解，但温度接近150℃时易分解），待冷却后再加入21ml浓硫酸混匀。另将3克砷酸氢二钠（Na2HAsO4·7H2O）溶解于25ml蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期备用。 （5）、200μg/mL葡萄糖标准液
(6)、1%糖标准溶液：葡萄糖和甘露糖各100mg，用75%乙醇溶液定溶至10ml。其浓度为10mg/ml。 (7)、展开剂：正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：乙酸：水=7；20：12：7：6（或正丁醇：吡啶：水=6：4：3）。 (8)、糖显色剂（苯胺－二苯胺－磷酸显色剂）：称取1g二苯胺，加入1ml苯胺。待溶解后加入50ml丙酮，最后加入5mlH3PO4，边滴加边搅拌。此溶液应透明、无浑浊。
(9)、 3mol/L硫酸； （10）、6mol/L NaOH；（11）、0.3mol/L磷酸氢二钠；（12）、乙醇（95%，无水）； （13）、丙酮；（14）、硅胶G（150-200目）。
2、器材：可见分光光度计、离心机、恒温水浴锅、层析缸、玻璃板、喷雾器。
四、实验步骤
1、魔芋葡甘聚糖的提取：称取魔芋粉5g,加入50ml 50%乙醇浸提,于50℃恒温水浴保温30min，不断搅拌，弃滤液，水洗3次，重复操作一遍。改用50ml 95%乙醇浸提两遍，最后用丙酮、无水乙醇分别淋洗一次，蒸去残留的丙酮和乙醇后得到魔芋葡甘聚糖精粉。 2、魔芋葡甘聚糖含量的测定：
（1）、葡萄糖标准曲线的制作：取7支试管，按下表操作，以标准葡萄糖浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 葡萄糖标准液管号 （mL） 0 0(参比) 1 2 3 4 5 6 提取液 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2ml 铜试剂沸水浴 （mL） 砷钼酸（mL） A620nm 2ml 振荡 2min 加水16ml 葡萄糖浓度（μg/ml） 0 10 20 30 40 50 60 蒸馏水（mL） 2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 2ml 10 min 冷却 （2）、魔芋葡甘聚糖精粉中游离还原糖的检验
取魔芋葡甘聚糖精粉1g，加适量菲林试剂加热，观察有无红色沉淀，若有再用95%乙醇浸提，直至与菲林试剂呈阴性反应。
（3）、魔芋葡甘聚糖提取液的制备和纯度检测
准确称取上述无游离还原糖的魔芋葡甘聚糖精粉0.200—0.250g，加水60ml，35℃水浴中溶胀2h，并不断搅拌。定容至100ml。4000r/min离心20min，其上清液即为魔芋葡甘聚糖提取液。取少许提取液，用碘—KI溶液检验。 （4）、魔芋葡甘聚糖的酸水解
准确吸取5.0ml葡甘聚糖提取液2份，分别置于具塞试管中，加入3mol/L硫酸2.5ml混匀，加塞沸水浴中水解1.5h，取出冷却至室温，再加入6mol/LNaOH 2.5ml中和，充分混匀过滤，得到魔芋葡甘聚糖水解液。
