（见比较表格）
4.植物细胞工程：培养植物细胞（包括原生质体），借用基因工程技术将外源DNA导入受体 细胞或通过细胞融合将不同源的遗传物质重新组合，再通过细胞培养，获得具有特定性状 的植株
Cf 细胞工程：细胞培养和细胞融合（若基因型不同为细胞杂交） ——基因定位：利用细胞杂交中染色体丢失与特定基因产物的对应关系
（三）动物细胞工程
1. 动物细胞培养 指明“动物”细胞培养
（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后
放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。
原理：细胞增殖
（2）动物细胞培养：
①取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）
②机械消化或用胰蛋白酶处理分散成单个细胞（利于细胞与培养液充分接触，进而吸
收氧气和营养物质并排出废物）
③制成细胞悬液→转入细胞培养瓶/卡式瓶中进行原代培养
——细胞间相互依存，呈现一定程度的组织特性，保持生长分裂、接触抑制、衰老死亡 ④贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来并分散成单个细胞稀
释分装传代培养（最初的若干次传代也归入原代培养）
——大多数细胞最终衰老、凋亡（①营养物质耗尽②遗传物质没变，衰老凋亡） 动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性
——可伴随组织分化，但主要的生命活动仍以细胞为单位；由于细胞运动变化， 培养物组分发生变异，长期培养最终成为简单的细胞培养 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞
数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 （4）动物细胞培养条件（液体培养基）
①无菌无毒：培养液和用具无菌处理，一定量的抗生素（种、量），定期更换培养液 ②营养：水无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素、动物（胎牛）血清、滋养细胞、激素 Cf天然(血清)和人工配制成分
③适宜渗透压、温度、pH（CO2培养箱：维持适宜的pH值7.2～7.4）
提高形成率的措施：①选择适宜的培养基和CO2、pH ②胰岛素等激素刺激③添加血清
④滋养细胞支持生长(经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞)
（5）细胞系：可连续传代的细胞（首次传代细胞即成为细胞系）
①连续细胞系 e.g异倍体 恶性（致癌）/不死性（保留接触抑制，不致癌） ②有限细胞系 e.g二倍体细胞
——传代培养的原因：①细胞密度过大 ②代谢消耗引起营养枯竭 细胞株：特殊的细胞系 （6）细胞克隆/克隆培养法：
定义：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体
特点：细胞群体来自于同一个细胞(否则具有异质性)，遗传性状均一，表达性状相似 要求：①最基本：分离出来的细胞是一个而非多个
②一般选择连续细胞系：对培养环境有较大适应范围并具有较强独立生存能力 用途：从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
动物难以克隆的根本原因：细胞分化过程中细胞质中的调节蛋白关闭了核中与个体发育有关的基因，使基因选择性表达，基因组中基因活动不完全 （1）原理：动物细胞核的全能性
（2）供核细胞：优良动物的传代培养10代以内的细胞
——后代性别由核供体动物个体的性别决定
受体细胞：去核的MII中期的卵母细胞 ——①细胞较大，容易操作
②细胞质营养丰富，具有调控细胞核发育、促进核基因表达的物质 （3）体细胞核移植的大致过程是：显微操作去核法
——多莉羊的成功说明：
①高度分化细胞经过一定技术处理，也可以回复到类似受精卵时期的功能 ②在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核发育的作用 ——无法培育出相同个体/克隆动物的基因来源：
①受体细胞的细胞质基因控制性状表达 ②细胞分裂中基因突变 ③环境因素 3.动物细胞融合 比较项目 细胞融合的原理 融合前处理 诱导手段 应用 植物体细细胞膜流动性 获得 （1）物理：离心、电①克服了远缘杂胞杂交 植物细胞全能性 原生质体 刺激、振荡 交的不亲和性 （2）化学：聚乙二醇 ②研究质遗传 动物细胞细胞膜流动性 细胞分散 （1/2）植物物化手段 制备单克隆抗体 融合 细胞增殖 （3）灭活的仙台病毒 ——细胞融合时可出现多种杂种细胞
专题3 胚胎工程
胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子（针对胚胎发育过程）所进行的多种显微操作和处理技术；研究对象主要限定于高等脊椎动物，尤其是哺乳动物；重点内容包括胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等。
（一）动物胚胎发育的基本过程
1、受精作用：成熟的精卵融合成为受精卵的过程（获能精子+减II中期的成熟卵细胞） 过程：精卵识别、精子附着于卵膜、精卵质膜融合
——受精时精卵质膜融合后，次级卵母细胞才最终完成减II，精卵核融合 场所：输卵管上段
2、胚胎发育：受精卵发育到幼体 胚后发育：出生到性成熟
个体发育：受精卵发育到性成熟 3、动物胚胎发育的基本过程
（1）卵裂期（2~8）：细胞数量增加，有机物总量/总体积减小，每个细胞都具有全能性， 未出现细胞分化，每个细胞都能发育成完整新个体 （2）桑椹胚（16~32）
（3）囊胚/胚泡：细胞开始分化，形成滋养层（胚胎附属结构/胚外结构）和内细胞团（胚 胎干/ES细胞，发育全能性），之间为囊胚腔 注意题目要求填写滋养层细胞还是滋养层 （4）原肠胚：三胚层分化，其将分化成各种器官原基；
——哺乳动物胚胎有机物总量增加（胚泡期已着床），其他动物有机物减少 PS 早期胚胎（桑葚胚和早期囊胚）
（二）胚胎干细胞
1、哺乳动物胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团（ES）或胎儿的原始性腺（EK） 2、形态特征：具有胚胎细胞的特性，体积小，核大，核仁明显，二倍体核型 功能特征：具有发育全能性
3、胚胎干细胞体外培养：分离早期胚胎中的内细胞团；胰酶处理解离培养
——饲养层（胚胎成纤维细胞）：促进生长，抑制分化 4、胚胎干细胞的主要用途是： ①基因敲除；
②用分化诱导因子诱导胚胎干细胞定向分化，组织器官移植； ③治疗人类的某些顽疾，修复坏死或退化的部位；
④胚胎干细胞核移植，经胚激活、胚胎培养、胚胎移植； ⑤改良和创造动物新品种
（三）胚胎工程的应用
1.体外受精
(1)卵母细胞的采集和培养：
①卵巢经促性腺激素处理超数排卵，使用超声监视器确定卵泡位置，插入穿刺针吸取 卵泡液，取出卵母细胞（各阶段卵母细胞均有可能） ②体外培养至成熟（减II中）
(2)精子的采集和获能（获得能与卵细胞结合的能力）：获能液由相关物质组成 非ATP (3)受精：获能精子和成熟卵细胞在体外合适环境中共同培养 ——试管动物/珍稀动物保护（体外受精） Cf克隆动物（核移植） 2.胚胎体外培养：
（1）由于胚胎不同发育时期生理代谢需求不同，需配制一系列含有不同成分的培养液； 由于哺乳动物胚胎发育条件复杂，尚不能实现胚胎全体外培养 （2）目的：检测受精状况和受精卵的发育能力
（3）培养液成分：水、无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、动物血清 （4）胚胎去向：①胚胎移植 ②液氮冷冻保存 3.胚胎移植
——胚胎可能来自受精卵/核移植/胚胎分割；8细胞期之后 (1)供体：经济价值高、遗传性状优良
受体：①同种 ②生理状态相同/同期发情但未配种
③常见或存量大 ④具有健康体质和正常繁殖能力
(2) 胚胎移植的意义：大大缩短供体的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力
(3) 生理学基础：
①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。 ②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。（胚胎收集）
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。（胚胎存活） ——若同种不需接受免疫检查，若不同种需要
④供体胚胎与受体建立生理联系（仅提供胚胎发育场所），但其遗传特性不受影响 (4) 基本程序主要包括：
①对供、受体的选择和处理：
同期发情处理（激素处理）：供体促性腺激素，受体前列腺素或孕酮 超数排卵：供体促性腺激素 ②配种或人工授精
③胚胎收集、检查、培养或保存：冲卵（早期胚胎） ④胚胎移植到受体的相应部位（输卵管/子宫角） ⑤移植后检查
——小型动物：促性腺激素处理，排卵后直接从输卵管中冲取卵子，直接参与体外受精； 早期胚胎之前的阶段即可移植
大型动物：从活体卵巢中吸取卵母细胞，经体外培养成熟后参与体外受精； 胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植
4.胚胎分割（无性繁殖） (1)意义：快速繁殖良种畜 (2)材料：早期胚胎
(3)操作过程（囊胚为例）：
(1)①用切割针/刀将内细胞团均等分割（否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育） ②采用酶处理将卵裂球中的细胞分散开
(2)分割的胚胎/细胞直接移植 或 体外培养至囊胚阶段再移植
HGP Human Genome Project
