然后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育培养；
（7）使用倒臵显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）；
（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。
5．结果判定
当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。
对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定为可疑阳性。
（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。 1．RNA提取
可使用多种商业化试剂盒来提取RNA，针对临床标本应选择质量较高的“用于临床标本病毒RNA提取的试剂盒”，也可使用全自动RNA提取仪进行提取。针对病毒分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化
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RNA提取试剂盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依据使用的试剂不同，严格按说明书进行操作。
2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） （1）引物序列合成
国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。各省CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级CDC。
1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列： PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3` PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`
2）EV71核酸检测引物序列：
EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3` EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`
3）CVA16核酸检测引物序列：
CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`
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CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`
（2）实验设计
1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。
2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。
A：阳性对照：参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。
B：阴性对照：使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。
C：试剂对照：用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。 （3）RT-PCR扩增反应和条件
1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上；
2）配下列试剂主溶液：
10×PCR Buffer···································································5.0μl dNTPs（2.5mM each）·······················································2.0μl 上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl 下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································0.5μl
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Taq DNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl AMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl 模板RNA··········································································3.0μl RNase Free dH2O···························································36.0μl
50.0μl
3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：
42℃························45min 95℃························3min 95℃························20s
45℃························25s ×32个循环 72℃························30s 72℃························10min 4℃························Soak
3．电泳分析
（1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装臵上；
（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl的PCR反应产物与之混合；
（3）将电泳缓冲液倒在电泳装臵中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；
（4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35-40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；
（5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向； （6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，
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