分子生物学实验
创新学院生物科学101班 韩宝泉 2010014871
本次大试验我们以大肠杆菌、幼嫩的小麦为原料，分别提取了质粒、DNA、RNA，并以其为主材料进行了诸如PCR、酶切、Southern杂交等实验项目，取得了较为良好的实验效果，以下为实验的总流程：
1. 质粒提取：①质粒1（GFP） 转化涂板 培养 Arabine培养基涂板 GFP表达观察 ②质粒2（P38）主要进行PCR、酶切、Southern杂交三项操作，其中PCR包括电泳检测、探针标记、Southern胶点样、T载体连接（包括转化、蓝白斑筛选、菌落PCR）。 2.植物DNA和RNA的提取：①gDNA提取 Southern胶点样、基因组酶切、基因组PCR ②RNA提取 RT cDNA PCR
实验过程
星期一 2012年5月21日
一、实验目的
1、 学习碱裂解法提取质粒的原理。 2、 学习质粒酶切和电泳分析。 3、 学习琼脂糖凝胶的制备。
4、 学习PCR反应的基本原理和实验技术。 二、实验原理
1、 质粒DNA的提取
利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 2、 琼脂糖凝胶电泳
溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。 3、 质粒DNA酶切
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。 4、聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA
聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。 PCR进行的基本条件：
①DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA） ②引物
③dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ④Taq DNA聚合酶 ⑤反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成：
①变性 使模板DNA解离成单链；
②退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
③延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
本实验以实验中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。 三、实验材料和设备 1、质粒DNA的提取：
含质粒的大肠杆菌，溶液Ⅰ（50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,1% SDS，必须新鲜配制），溶液Ⅲ（pH4.8的醋酸钾溶液），TE缓冲液（pH 8.0），无水乙醇和70%乙醇。 2、琼脂糖凝胶电泳：DNA样品，TBE缓冲液（5×，用时需稀释10倍），点样缓冲液Loading buffer（10×），溴乙啶(EB)，琼脂糖 3、质粒P38酶切（30ul体系）：EcoRⅠ酶（1ul），P38质粒（10 ul），buffer（10×，3ul）,水（16ul）
4、P38的PCR（30ul体系）：2×Mix（15ul），正向引物P1（1ul），反向引物P2（1ul），P38（1ul），水（12ul） 四、实验步骤及方法
1、 质粒DNA的提取（P38需菌液3ml，GFP需菌液1.5ul）: ①将菌液移入1.5ml 离心管，离心30s（13000rpm），倒去上清液，重复一次，收集3ml 菌液。
②加入100μl预冷的溶液Ⅰ(含5ug/μl RNAase)，用涡旋震荡器充分悬浮。
③加入150μl溶液Ⅱ，快速颠倒温和混匀，室温放置5min。此时溶液应非常粘稠。 ④加入150μl 预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），在冰浴中5min。 ⑤12000rpm离心10分钟。转移上清液400ul至另一1.5ml离心管中。 ⑥加800 μl乙醇到上清液中，混匀， 12000rpm离心10min，除去上清（尽可能除去残液）。 ⑦用0.5ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，除去乙醇。开盖干燥10min,加50ul水，
快速离心10s,备用。 2、凝胶的制备
将5×TBE缓冲液25ml稀释10倍或250ml溶液。加入1.5g琼脂糖粉，加热混匀于150ml配好的溶液中，制成1%的凝胶溶液，待溶液冷却至60摄氏度左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除去气泡，待凝固后使用。 3、质粒GFP及P38的凝胶电泳
①在一次性手套上均匀点上一些Buffer。
②用移液枪吸取5ul的GFP使其与Buffer混匀。 ③将混合物进行点样。
④P38的点样与GFP的基本一致。
⑤开启电泳槽，电泳后用EB处理后拍照分析。 4、 P38的酶切
按上述30ul酶切反应体系加入原料，快速离心混匀，置于37摄氏度水浴中，备用。 5、 P38的PCR
按上述30ulPCR反应体系加入原料，快速离心混匀，冰浴，设置PCR程序（变性温度94摄氏度，退火温度55摄氏度，延伸温度72摄氏度，最后温度16摄氏度，其中循环30次），运行进行PCR操作，在低温下保存。 五、实验结果
对刚提取出的质粒GFP和P38做电泳，可以观察到我们所提取的DNA的量的大小以及纯度。试验中我们所得到的电泳条带都在上方有一条较亮的条带，且P38的最亮条带较高，说明我们所提取的质粒DNA量足且纯度高。
星期二 2012年5月22日
一、实验目的
1、学习质粒的酶切及电泳分析。
2、学习用电泳结果分析酶切、PCR的工作结果。
3、掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 4、掌握感受态细胞的制备方法。
5、学会Southern杂交的原理及操作方法。 6、掌握用诱导物诱导外源基因表达的方法。 二、实验原理
1、P38酶切产物电泳分析
限制性内切酶将P38酶切后会生成相应的DNA片段，将其电泳处理会呈现2—3条区带，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。 2、P38PCR产物电泳分析
由PCR扩增出来的DNA片段会很多，因此电泳处理会产生一条粗且非常明亮的条带。 3、质粒载体和外源DNA的连接反应
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。载体与外源DNA的连接是否成功可用蓝白斑筛选。 4、感受态细胞的制备及转化
感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1mol/LCaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源 DNA进入细胞。 5、地高辛标记的Southern杂交
Southern印迹杂交包括两个步骤①把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。
地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。
所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1×SSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。 6、阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达
绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。 三、实验材料和设备 1、电泳：Buffer试剂 2、质粒载体和外源DNA的连接反应：P38的扩增引物，T4DNA连接酶，T—easy载体，Buffer 3、感受态细胞的制备及转化：0.1mol/LCacl2，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/ml），
