技术方法名称:
Protein A sepharose 4 fast flow亲和层析柱纯化人IgG1类嵌合抗体
基本原理： 葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A）在pH值中性或碱性条件下与多种哺乳类动物IgG分子的Fc段特异结合，而在酸性条件下可以解离，可用于纯化人和小鼠IgG及其亚类（IgG3除外）。sepharose 4 fast flow是高度交联的4%的agarose衍生物，具有很好的动力学，在固相亲合吸附中有很好的层析质量，其刚性使其可理想地用于生产规模。Protein A sepharose 4 fast flow是protein A 与 固相基质sepharose 4 fast flow的结合，是高特异、高稳定性凝胶，当凝胶装填柱床后，能够特异性捕获目的抗体。
用途及受限因素：
1、Protein A sepharose 4 fast flow的 IgG高载量和允许样品通过的高流速，使其成为实验室和生产规模制备抗体的理想凝胶。
2、Protein A sepharose 4 fast flow在纯化过程中会有少量集团脱落，如需去除用离子交换Q Sepharose HP或凝胶过滤superdex 200。
3、在不同IgG亚类之内，甚至在相同亚类之内，都存在着天然的多样性，因此对于每个待纯化的单抗都必须首先优化选择结合和洗脱系统。 4、层析几批样品之后，尤其流速明显减慢之后，需重装柱子。
实验材料：
1. 1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱
生产厂商：pharmacia公司
2. 有抗体分泌的细胞上清
（本实验室构建的嵌合抗体为人IgG1类嵌合抗体，宿主细胞CHO） 3. 柱体平衡液：0.1M PB缓冲液 （PH7.0）
4. 抗体洗脱液：0.1mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（PH3.0） 5. 1mol/L Tris碱溶液（不调PH）
6. 透析液：0.01M PBS （ PH7.4） 7. 20%乙醇 8. 0.45μm滤器 9. 真空泵
（本操作流程操作程序以1ml凝胶为例）
实验设计： 1．样品处理：
● 取一定体积的有抗体分泌的细胞培养上清。
（根据1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱能有效结合约14mg的抗体，结合待纯化上清中抗体含量，计算出最大纯化上清的体积） ● 将细胞上清4℃离心10000rpm×20min，去除细胞碎片。
● 细胞上清经0.45μm滤膜抽滤脱气，除去未沉降的蛋白等一些杂质，留样1ml，记录样品体积。
● 用10mM的NaOH调节上清的pH值至7.0左右。 2．平衡柱子：
以0.1M的PB（PH7.0）缓冲液平衡1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min，体积>20ml ，充分去除乙醇和杂质，平衡至OD280<0.01。 3．上样：
将上述处理过的样品液以1ml/min 流速上样，样品温度应保持与柱床温度一致，否则容易产生气泡，影响柱效。收集流穿液，混匀后取样1ml，记下流穿液体积。 4．洗涤：
以0.1M的PB（PH7.0）缓冲液洗涤上样后的1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速2ml/min，体积>50ml ，洗涤至OD280<0.01，保留液体待测。 5．洗脱：
以0.1M的柠檬酸（PH3.0）缓冲液洗脱上样后的1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min,体积不限，分管收集，同时用1M Tris调其PH至7.0左右，洗脱至OD280<0.01，保留液体待测。 6．纯化后抗体处理：
● 用分光光度计测OD280，初步计算产量。
● 将该样品置于透析袋中，在PBS（PH7.4）中透析，换液2—3次，6-8h/次。 ● 将样品用无菌的0.2μM的滤器过滤纯化的抗体，然后分装于1.5ml无菌塑料管中，–20℃储存备用。 7．再生:
再以0.1M的柠檬酸（PH3.0）缓冲液再生洗脱后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min，体积3-5ml。 8．保存：
以含20%乙醇的PBS（PH7.4）平衡再生后的洗脱后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱，流速1ml/min，体积30-50ml。关闭柱子，整体浸泡在含20%乙醇的PBS（PH7.4）中，4℃保存。
注意事项：
1．本实验全过程应尽量在4℃下操作。
2．细胞上清必须高速离心并过滤，防止污染柱料。 3．防止柱子流干、冻冰。
4．上样液置于4℃下上样，上样一段时间后流速将下降，应尽量排除柱内气体。 5．洗脱时，换洗脱缓冲液应注意排除凝胶表面前步残留液体体积，防止影响洗脱效果。
6．流穿液和每步洗柱液应保留，待实验完毕后统一处理。
结果观查及分析的原则
采用分光光度计测OD280，按1mg=1.35OD280计算抗体量。同时结合夹心ELISA检测上样前与上样后嵌合抗体含量的变化，以计算上样结合量，得出纯化效率。
实验成功或失败的关键因素
pH值在中性或碱性条件下，ProteinA和人源抗体Fc段能够特异性结合，而在酸性条件下可以解离，因此洗涤液和洗脱液的pH值是纯化成败关键。
