编码：ZL-SOP-QC-704A
沙门氏菌检验操作程序
1. 目的：建立沙门氏菌检验的标准操作程序，保证正确操作。 2. 适用范围：本标准适用于沙门氏菌检验。 3. 职责：质量技术部QC
4. 引用标准：GB-4789.4-2010 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 5. 内容
5.1 沙门氏菌检验:适用于食品中沙门氏菌的检验。 5.2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： ⑴ 冰箱：2 ℃～5 ℃。
⑵ 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 ⑶ 均质器。 ⑷ 振荡器。
⑸ 电子天平：感量 0.1 g。
⑹ 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。
⑺ 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液 器及吸头。
⑻ 无菌培养皿：直径 90 mm。
⑼ 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 ⑽ 无菌毛细管
⑾ pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 ⑿ 全自动微生物生化鉴定系统。 5.3 培养基和试剂
5.3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）： 见附录 A 中 A.1。
5.3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中 A.2。 5.3.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中 A.3。 5.3.4 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录 A 中 A.4。 5.3.5 HE 琼脂：见附录 A 中 A.5。
5.3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录 A 中 A.6
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5.3.7 沙门氏菌属显色培养基。
5.3.8 三糖铁（TSI）琼脂：见附录 A 中 A.7。 5.3.9 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A 中 A.8。 5.3..10 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录 A 中 A.9。 5.3..11 氰化钾 （KCN） 培养基：见附录 A 中 A.10。 5.3..12 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A 中 A.11。 5.3..13 糖发酵管：见附录 A 中 A.12。
5.3..14 邻硝基酚-D 半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录 A 中 A.13。 5.3..15 半固体琼脂：见附录 A 中 A.14。 5.3..16 丙二酸钠培养基：见附录 A 中 A.15。 5.3..17 沙门氏菌 O 和 H 诊断血清。 5.3..18 生化鉴定试剂盒。 5.4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图 1。
图 1 沙门氏菌检验程序
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5.5 操作步骤 5.5.1 前增菌
称取 25 g（mL）样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中，以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min～2 min，或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。若样 品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定 pH 值，用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8±0.2。
无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养 8 h～ 18h。如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。 5.5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 5.5.3 分离
分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h （XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或 40 h～48 h （BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板
BS 琼脂 HE 琼脂
沙门氏菌
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈
黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。
按照显色培养基的说明进行判定。
XLD 琼脂 沙门氏菌属显色培养基
5.5.4 生化试验
5.5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三
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糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属 的反应结果见表 2。 表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 斜面 K K A A K 底层 A A A A K 产气 ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋/－ ＋/－ 硫化氢 ＋（－） ＋（－） ＋（－） ＋/－ ＋/－ 赖氨酸脱羧酶试验培养基 ＋ － ＋ － ＋/－ 初步判断 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 可疑沙门氏菌属 非沙门氏菌 非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。 注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性； ＋/－：阳性或阴性。 5.5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试 验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌 落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。 表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 A1 A2 A3 硫化氢 （H2S） ＋ ＋ － 靛基质 － ＋ － pH7.2尿素 － － － 氰化钾 （KCN） － － － 赖氨酸脱羧酶 ＋ ＋ ＋/－ 注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 5.5.4.3 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。 表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN） － － ＋ － ＋ － 赖氨酸 脱羧酶 － ＋ ＋ 判 定结果 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性） 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：＋表示阳性；＋表示阴性。
