考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量
吴凡 郭梦雨
摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光
度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。
关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物 1 实验部分 1.1 实验原理
果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h
内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。
1.2 实验准备 1.2.1 实验材料
新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2 、抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇。
1.2.2 仪器与设备
容量瓶（25mL 10个、100mL 1个、500mL 1个、棕色瓶 1个、分析天平、胶头滴管、烧杯（50mL 2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL 1个 、25mL 1个）、研钵、移液枪（1000μL）
UV-1800型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。
1.2.3 试剂配制
1.2.3.1 标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL； 1.2.3.2 考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25mL 90%乙醇中，加入50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中； 1.2.3.3 提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)；
1.2.3.4 梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L； 1.2.3.5 外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、 半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%，V/V)。
1.3 实验步骤
1.3.1考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描
取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400～800nm范围内进行扫描，确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。 1.3.2 标准曲线的绘制
取6支试管，按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程
表 1 绘制标准曲线的各试剂添加量
项目 管号 0 100μg/mL 牛血清白蛋白溶液/mL 蒸馏水/mL 1 0.2 2 3 4 5 0 0.4 0.6 0.6 0.4 0.8 1.0 0.2 0 1.0 0.8 1.3.3 果蔬组织可溶性蛋白质的提取 1.3.3.1 最佳缓冲溶液和pH值的确定
称取苹果果肉样品1g，加入5mL水或梯度pH值Tris-HCl缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用。 1.3.3.2 最佳提取缓冲液浓度的确定
以上节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH值下浓度依次为0、10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液[9]。提取体系及方法同1.3.1节。 1.3.3.3 适宜外源添加物的确定
以上节确定的最佳缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法同1.3.1节。（添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇） 1.3.3.4 苹果组织可溶性蛋白质含量的测定
吸取1.0mL样品上清液，放入试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5min后在波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度。重复3次。 1.3.3.5 数据处理
Excel 统计分析所有数据，计算标准误差并制图。
2 结果及讨论 2.1 标准曲线的绘制
表二 不同吸光度值对应BSA含量
