RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。RFLP技术在用于基因型分型研究的同时，同样的可用于在不同环境中微生物多样性的研究。
RFLP技术主要包括以下基本步骤:
DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段(Southern杂交)和结果分析。 优缺点
RFLP遍布低拷贝编码序列，并且非常稳定，但RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，不适于大规模的分子育种，在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。
与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD 而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。 基本类型 点的多态性折叠
表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。 序列多态性折叠
因DNA链内发生较大部分的缺失、重复、插入等变异，其结果是即使其内切酶位点碱基序列没有变化，但原有的内切酶位点相对位置发生变化从而导致RFLP。
RAPD: random amplified polymorphic DNA
RAPD是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。 RAPD即随机扩增多态性DNA标记，其基本原理与PCR技术一致。 基本概述
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增。聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。 相关原理
RAPD是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。 主要特点 RAPD的优势。
① 无需专门设计RAPD 扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，长度一般为9- 10 个核苷酸；
② 每个RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性；
③ 退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，使RAPD 有较高的检出率； ④ RAPD 技术简便易行、省时省力，不需要RFLP 分析的预备性工作：如克隆的制备、同位素标记、Southern 印记反应及分子杂交。RAPD 易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析；
⑤ RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，这对于生物早期取样鉴定或在DNA 受限制的情况下是十分有利的。 解决方法
（1）扩增偏差或无扩增。
―在部分或全部管中缺少一个组分。
―PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。 ―在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。 ―稀释新的DNA溶液。
―引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。
―延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。 ―提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。 ―补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。 （2）扩增结果差，条带模糊或难以辨认。 ―更换Taq聚合酶缓冲液。
―检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16% 6mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。
―检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。 ―改变DNA浓度。
（3）高相对分子质量产物弥散状分布>4kb。 ―降低DNA浓度。 ―降低Taq聚合酶浓度。 ―减少凝胶上样量。
―可能是由于循环数过多的结果，减少循环数。 ―确认是否使用正确的缓冲液制备凝胶。 ―在较低的电压下电泳。
（4）在对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。
―确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。 （5）带谱不可重复。
―DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100ng范围之内，DNA量太少时，“真
正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。 ―只考虑主要条带。
（6）染色后凝胶背景太强影响分辨率。 ―减少染色时间。 ―凝胶脱色时间延长。
―PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。 （7）低相对分子质量产物分离不充分。
―在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物 。 技术问题 1 温度
RAPD一般反应条件是：变性92－95℃，常用94℃，30－60s；退火35－37℃，30－60s；延伸72℃，60－120s。变性和延伸温度一般没有太大变化，而退火温度影响较大。退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多；退火温度高，引物和模板结合特异性增加。有人提出，在寻找基因差异为目的的实验中，退火采用33－34℃效果更好。在优化方案中，退火温度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的＂带＂。温度的梯度率也是十分重要的，特别是退火与延伸之间的梯度尤为重要。各种仪器的控温、升降温性能均有差别，一些仪器（如一些旧型号的仪器）在到达特定的温度前就开始计时，一些PCR仪显示的温度与实际温度会有差异。这些在设计程序和结果分析时有必要考虑，所以注明所用仪器的生产厂家、品牌、规格，就显得很有必要，对于同一批实验，注意控制在同样的温度条件下进行反应，结果才有可比性。 2 反应物的影响
PCR扩增受多种成分的制约，产物仅在部分循环中呈指数式增长，逐渐将达到一个平台期，模板是关键制约因素之一，RAPD产物取决于此，实验中非常精确的模板浓度是十分关键的一个步骤。浓度过低，分子碰撞机率低，偶然性大，扩增产物不稳定；浓度过高，会增加非专一性扩增产物。更重要的是，若循环数控制不好，引物过早消耗完，后面循环中，PCR扩增产物的3端会和原模板及每一次循环的扩增产物退火，造成不等长度的延伸。因此，如果原模板浓度过高，非专一性扩增产物就足以形成背景，这是高浓度模板造成弥散型产物的原因。相对而言，模板纯度影响不大，即反应液中蛋白质、多糖、RNA等大分子物质影响不大。理想的模板和引物浓度能产生多态性丰富、强弱带分明的RAPD图谱。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg＋2浓度也影响反应的参数包括产物的特异性和引物二聚体的形成，人们在各自的实验中得出不同的结论，大约在1.5－4mmol/L范围内。总之，各种反应物的浓度应事先进行筛选优化。
