基础生物学实验
实验三 植物愈伤组织培养
一． 实验目的：
通过植物愈伤组织培养实验的学习和训练，使学生了解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。 二． 实验原理：
根据植物细胞全能性原理培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。 三、实验内容
该实验包括2部分内容:
实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存 实验1-2、MS培养基的配制与灭菌
实验1-1 植物组织培养基母液的配制和保存。
1、目的要求
学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制做准备。 2、基本原理
植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度按比例稀释。本实训以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。MS培养基母液可
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分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。 3、实验仪器设备和试剂 3.1仪器、用具
分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。 3.2试剂
（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 （2）MS培养基成分：
①大量元素(母液Ⅰ)：NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4； ②微量元素(母液Ⅱ)：KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O；
③铁盐(母液Ⅲ)：FeSO4.7H2O、Na2.EDTA.2H2O；
④有机成分(母液,维生素和氨基酸)：肌醇、盐酸吡哆醇(维生素B6)、烟 酸(Vpp)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸； （3）植物生长调节物质：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。 4、操作步骤
（1） MS大量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表4-1中的次序分别准确称量后，分别用50ml 烧杯，加入蒸馏水30 ml溶解（可以加热至60℃～70℃，促其溶解）。溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表1 MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量
培养基用量1L培养基吸取扩大倍数 称取量(mg) 母液体积(mL) （mg/L） 母液量（mL） 10 4,750 4,125 2
母液 化合物名称 大 KNO3 NH4NO3 1,900 1,650 250 100 基础生物学实验
量 MgSO4·7H2O KH2PO4 元 CaCl2·2H2O 素 370 70 440 9,25 425 1,100 （2）微量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍（表4-2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表2 MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量
培养基用量（mg/L） 22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 100 称取量母液体积1L培养基吸取(mg) 223 86 62 8.3 2.5 10ml* 10ml** 100 10 (mL) 母液量（mL） 母液 化合物名称 MnSO4·4H2O 扩大倍数 微 ZnSO4·7H2O 量 H3BO3 KI 元 Na2MoO4·2H2O 素 CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O *、**：因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g，溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。
（3） 铁盐母液的配制
常用的铁盐是FeSO4·7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。配
制时，按照扩大后的用量（表4-3），分别称取FeSO4·7H2O和Na2-EDTA，分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液(需加热溶解)，搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表3 MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量
母液 化合物名称 培养基用量扩大倍数 称取量母液体积1L培养基吸取3
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（mg/L） 铁盐 Na2-EDTA FeSO4·7H2O 37.3 27.8 100 (mg) 373 278 (mL) 100 母液量（mL） 10
（4）有机物母液的配制
按照表4-4 中各成分浓度扩大后的用量，用感量0.0001g天平分别称量各有
机物。可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/L NaOH溶液溶解；VH（生物素）先用1mol/L NaOH溶液溶解；VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
表4 MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量
母液 有机物名称 甘氨酸 VB1 机 物 VB6 烟酸 肌醇 母液体积1L培养基吸取母培养基用量 扩大倍数 称取量(mg) （mg/L） (mL) 液量（mL） 2.0 0.4 0.5 0.5 100 100 20 4 5 5 1,000 100 10 有
（5）激素母液的配制
激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是
0.1～2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。称量激素要用感量万分之一天平。本实验选用激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。2，4-D母液的配制方法为：准确称取10mg 2,4-D，称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即得到0.1mg/ml的2,4-D贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 （6）在配制母液时应注意： ①培养基各试剂应使用分析纯。
②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。
③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日
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