? 实验前带上口罩和新手套，并用70%酒精将实验台擦拭一遍。 ? 移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严。 ? 使用超纯水稀释标准品。
3.3 稀释样品
1）如果待测文库是需要混合的Index文库，则先按照《Q-PCR pooling规则》混合好，贴好标签等待检测。
2）取和待测样品数量相同的0.6 ml PCR 离心管，分别标记为待测样品名称或者是样品管盖上的记号。
3）如果待测样品体积小于15ul（如表达谱、Small RNA组的样品），则分别吸取99 μl超纯水至每个离心管中；如果待测样品体积大于15ul，则分别吸取198 μl超纯水至每个离心管中。
4）将待测文库的样品原管充分振荡，短暂离心后，按照Q-PCR实验登记表上的顺序排好，然后分别移取样品溶液至相对应的装有超纯水的离心管中，如果样品体积小于15ul的，则吸取1ul的样品到装有99ul超纯水的离心管中；如果样品体积大于15ul，则吸取2ul样品到装有198ul超纯水的离心管中。振荡10至15秒，短暂离心。
5）将已稀释的样品置于4 ℃或冰上；将样品原管放回-20 ℃冰柜中的编号盒存放，将样品放到编号盒中腾空的位置，并将样品的文库号用扫描枪录入“文库核对&存放位置”文件夹中的《上机文库存放位置表》Excel表中的对应位置存档。
【注意】
? 移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严，吸取样品后确
保管盖盖严。
? 使用的超纯水稀释样品。 3.4 配制反应预混液
1）到隔壁实验室的“Mix配制区”配制反应预混液。取1.5 ml或2 ml离心管，在管盖上标记上Mix，套上锡箔纸。
2）按以下反应体系准备反应预混液（以8个PE样品、1条标准曲线和10个SE样品、2条标准曲线为例）：
表3-4-1 PE Mix的配置
组分 1次反应所需用量（μl） 37次反应所需用量（μl） PE Mix dNTP(2.5mM) Probe ROX PE PCR Primer1.1 Index PCR Primer RR EX Taq HS Template Total 7.05 0.8 0.25 0.2 0.3 0.3 0.1 —— 9 260.85 29.6 9.25 7.4 11.1 11.1 3.7 —— 333 *标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样品3个反应孔，2
孔用于移液损失，共37孔。
表3-4-2 SE Mix的配置
组分 SE Mix dNTP(2.5mM) Eva Green ROX SE PCR Primer1.1 SE PCR Primer2.1 EX Taq HS Template Total 1次反应所需用量（μl） 53次反应所需用量（μl） 7 0.8 0.5 0.2 0.2 0.2 0.1 —— 9 371 42.4 26.5 10.6 10.6 10.6 5.3 —— 477 *2条标准曲线，标准品5个浓度各2个反应孔，NTC（无模板对照）1个反应孔，每个样
品3个反应孔，2孔用于移液损失，共53孔。
其中，PE Mix和SE Mix的组分和每孔反应所需的用量如下表： 表3-4-3 PE Mix 表3-4-4 SE Mix
组分 所需用量（μl） 1 0.1 0.1 0.5 3.35 2 组分 所需用量（μl） 1 0.1 0.1 0.5 3.3 2 7 10× Buffer MgSO4 Tween 20 100× DMSO H2O Betaine Total
10× Buffer MgSO4 Tween 20 100× DMSO H2O Betaine Total 7.05 3）上下颠倒离心管混匀或振荡10至15秒，短暂离心。 4）将反应预混液置于4 ℃或冰上。 【注意】
? 配制反应预混液必须到“Mix配制区”进行，避免扩增子污染。 ? 移取PE Mix或 SE Mix前，摇晃离心管以彻底混匀。 ? 使用超纯水配制反应预混液。
? Mix配制区的所有物料，仪器，工具都严禁带到其他区域。
3.5 加样
1）Mix配制好之后，将Mix放在传递窗中，回到稀释样品的实验室，将Mix从传递窗中取出，并在“点样区”进行加样。
2) 取出96孔国产光学反应板置于基座上。
3） 将预先配好地反应预混液加到各反应管孔中，每孔加入9μl 反应预混液。然后按照由A到H、由1到12的顺序向反应孔中加入1 μl 已稀释的标准品、样品和阴性对照，向标准品反应孔中加入1 μl 梯度稀释的标准品，每个梯度重复两次；向样品反应孔中加入1 μl 已稀释的样品，每个样品重复三次；向无模板对照（NTC）反应孔中加入1 μl 已灭菌超纯水。
4）使用ABI公司配备的封膜工具和光学封口膜（泛特津）封闭反应板。 5）封好膜之后，到荧光定量PCR仪放置的实验室，使用Labnet 的MPS-1000微孔板离心机离心反应板，离心时间为4min。离心前注意配平。板子放置时，底部朝外。
6）将反应板装载到StepOnePlus扩增仪以准备运行。
3.6设置反应程序 3.6.1 双击
3.6.2 如果有设置好的程序模板，则点击菜单栏的“Open”在“桌面/Q-PCR Results/Q-PCR Templates”里找到和《Q-PCR实验登记表》上名字相同的程序模板，在Experiment Name栏中用“检测人姓名拼音+检测日期+程序名称”命名，然后根据标准品和点样的顺序设置好板位，输入标准品名称和样品名称，并将设置好的程序保存在“桌面/Q-PCR Results/Q-PCR Results”中以检测日期命名的文件夹中。
3.6.3如果没有程序模板的，则在 Set Up 列中，单击 Advanced Setup ，如图3-1。
桌面 StepOne software v2.0 软件快捷键。
图3-1
3.6.3.1 在左侧导航窗格中，单击 Experiment Properties ：
1） 单击 Experiment Name ，然后输入实验名称，如图3-2所示。 2） 单击 StepOnePlusTM Instrument（96 well）。
