western blot
实验目的：检测样品中的β-actin。
实验原理：经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜，Polyvinylidene fluoride）上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的目的蛋白。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 实验步骤：
（一）SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
本实验采用既有浓缩胶又有分离胶的不连续系统，聚丙烯酰胺凝胶电泳在不连续缓冲系统中进行，具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，大大提高了SDS-聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度（％） 线性分离范围（KD）
15 10～ 43 12 12～ 60 10 20～ 80 7.5 36～ 94 5.0 57～212
（1）实验步骤
1．准备SDS-PAGE凝胶用玻璃槽：将两块特制玻璃板固定于制胶板上。确定灌制分离胶液面标志线（距样品梳子底部约0.5-1.0cm处）。
2．检漏：将1mL 去离子水加入凝胶槽中，若漏水需重新安装。 3．配制10%SDS-PAGE分离胶 (5ml)： 去离子水 1.9ml 30%丙烯酰胺 1.7ml
1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 1.3ml
10%过硫酸胺 0.05ml 10%SDS 0.05ml TEMED 0.002ml
混匀后用吸管轻轻加入凝胶玻璃槽中，使其液面至标志线位置（避免产生气泡）。 4．立即用去离子水覆盖胶面（隔绝空气，有助于凝胶聚合，使凝胶面形成平直），室温放置约20min至分离胶凝固。 5．配制5%浓缩胶2ml：
去离子水 1.4ml 30%丙烯酰胺 0.33ml 1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 0.25ml 10%过硫酸胺（一周内使用） 0.04ml 10%SDS 0.02ml TEMDE（临灌胶前再加） 0.002ml
6．倒掉覆盖液，用吸水纸吸掉残留的液体。
7．将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶（注意避免产生气泡），插入样品梳，室温凝胶约20min。
8．将胶版放于电泳槽中，缓慢加入1X电泳缓冲液。轻轻拔去梳子，待点样。
9．吸取细胞总蛋白样品5ul加入1..5mlEP管中, 每样品管中分别加入5ul 2×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，95℃变性3min。（高温的目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。）
10．吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中。
11．将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V使样品通过浓缩胶（电压约8v/cm）。当染料进入分离胶后，将电压调高到100V，继续电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳，关掉电源。（样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带） （2）试剂配制
1．30% 丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺，29克；N,N’-亚甲双丙烯酰胺，1克，去离子水分别溶解上述后，再补去离子水至100ml。过滤，储于棕色试剂瓶中，4℃保存一月。（丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故应注意防护） 2．1.0mol/L Tris-HCl pH 6.8
3．1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8
4．10%SDS（室温保存）: 去离子水配制
5．10%过硫酸铵（4℃保存）： 提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必须的自由基；由于过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制（去离子水配制）。
6．TEMED（N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺）：催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合；
7．5×Tris -甘氨酸电泳缓冲液(1000ml): Tris 15.1g 甘氨酸 94g SDS 5.0g 补去离子水 至 1000ml 使用前做5×稀释。 8．2×蛋白质电泳上样缓冲液
Tris-HCl pH 6.8 0.1mol/L SDS 4% 溴酚蓝 0.2% 甘油 20% β-巯基乙醇 0.2 mol/L
SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； ?-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。溴酚蓝染料用于控制电泳过程。 9. 蛋白质预染Marker （Fermentas公司）
（二）、转膜
电泳结束后，需将凝胶上分离到的蛋白条带转印至固相支持物上，本实验采用PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜，Polyvinylidene fluoride）作为固相支持物。转膜的方式有湿转和半干转，本实验采用湿转方法。
1．取一托盘，放入少量转膜缓冲液（25Mm Tris-CL，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH 8.3），将凝胶剥于其中，同时切去多余的凝胶（浓缩胶和无样品部分），量取凝胶的长度和宽度。 2．剪下相应大小（膜的长宽分别比胶大1-2mm）的PVDF膜，在100%甲醇中浸泡15秒（活
化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合），转移至纯水中2分钟；然后再至转膜缓冲液中平衡至少5分钟。同时剪下4张滤纸（滤纸的长宽分别比胶小1-2mm）于托盘中浸湿。
3．组装：顺序为：阴极（黑色）海绵垫片－》2层滤纸－》胶－》膜－》2层滤纸－》海绵垫片。去气泡。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
4．转膜：100V，1-2小时。（此步操作宜在4℃冰箱中进行）
5．转膜结束后，镊子取出膜，在TBST缓冲液（20mM Tris-CL，pH 7.5，150mM NaCL，0.05％ Tween-20）中漂洗数分钟。
（三）、检测
1．将膜转入10ml封闭液（5％脱脂奶粉，TBST配制）中，室温、摇床上缓慢摇动封闭1h。封闭膜上未结合位点。
2．一抗反应：用TBST按 1:500稀释一抗（Rabbit Anti-β-Actin），5mL/2块胶，将封闭完成后的膜放入其中，室温、摇床上缓慢摇动1 h。TBST洗膜3次，5min/次，洗去未结合的一抗。
3．二抗反应：TBST稀释碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗兔IgG（1：3000），6mL/2块胶，室温、摇床上缓慢摇动1 h。再用TBST洗膜3次。洗去未结合的二抗。
4．显色：蒸馏水配制NBT/BCIP（20X）显色液，1mL/胶，将显色液滴加于膜上，室温避光反应2min，显色条带清晰后蒸馏水冲洗终止反应。（NBT即四唑氮蓝，为深蓝色无定形微溶物质；BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐，当二者存在时，在碱性磷酸酶作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成可见的蓝色或紫蓝色沉淀。）
各位老师请注意，由于实验设备有限，为保证每位老师都有亲自动手的机会，现将实验安排调整如下：第1-6组实验时间为4月2日；7-11组实验时间为4月9日。 实验分组： 4月2日：
1 陈桂敏、许琼军、戴华 2 陈锦龙 、龙文芳、梁振钰 3 牛莉娜、王军、陈应奇 4 饶郎毓、郁春、左琦 5 芦亚君、孙涛、张显芳 6 姜月霞、张黎、翁启芳 4月9日
7 刘启兵、吴芸菲、王勇 8 曾祥周、曹娟、郑小妹 9 王明华、曾蓉蓉、杨黎艳 10 唐立波、陶石、黄华萍 11 尤晓光、张瑞城、王清
