实验八 电泳技术——纸电泳分离氨基酸
一、实验目的
1.了解电泳技术的基本原理； 2.掌握纸上电泳的原理和操作技术。 二、实验原理
带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳（electrophoresis）。电泳现象早在1808年就被发现，但是作为一项生物化学研究的方法学，却是在1937年Tiselius在电泳仪器方面取得重大成就后，才得到较大的进展。特别是后来应用滤纸作为支持物，形成了设备简单，操作方便的纸上电泳法后，电泳技术在生物化学和其他领域研究中得到了广泛的应用和发展。近年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。
目前所采用的电泳方法，大致可分为三类：显微电泳，自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用比较广泛，按其支持物物理性状的不同可分成4大类：
1.滤纸及其他纤维（如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳。 2.凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。 3.粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃分电泳。
4.线丝电泳：如尼龙丝，人造丝电泳。此为微量电泳方法。
区带电泳现已广泛应用于生物化学物质的分析分离以及临床检验等方面。现以纸上电泳为例介绍有关电泳的原理和操作技术。
任一物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其他带电质点，在电场中便会向一定的电极移动。例如氨基酸、蛋白质分子等，由于它具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，如-COO－和-NH3+等，它是一典型的两性电解质，在一定的pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及溶液的pH值和离子强度。在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这—pH值，称为该蛋白质的等电点(pI)。如果溶液的pH小于pI，则蛋白质分子结合一部分H，而带正电荷，在电场中就会向负极移动。反之，溶液的pH大于pI，则蛋白质分子会解离出—部分H而带有负电，此时蛋白质分子在电场中就会向正极移动。
不同的带电颗粒在同—电场中泳动速度不同，常用迁移率(或称泳动度，mobility)来表示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
m?v/E?d/tV/l?dl/tV
式中：m为迁移率(cm2/V·s)；v为颗粒的泳动速度(cm/s)；E为电场强度(V/cm)；d为颗粒泳动的距离(cm)；l为滤纸的有效长度(cm)，即滤纸与两极溶液交界面间的距离；V为实际电压(V)；t为通电时间秒(s)。
通过测量d，l，v，t便可计算出颗粒的迁移率。
带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量，颗粒的大小和形状有关。一般说，所带净电荷量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中的泳动速度愈快，反之则愈
慢。泳动速度除受颗粒本身性质的影响外，还和其他外界因素有关。
现将影响颗粒泳动速度的外界因素讨论如下：
1、电场强度：电场强度是指每lcm的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。电场强度对泳动速度起着决定性作用。电场强度愈高，则带电颗粒泳动愈快。例如进行纸上电泳时，滤纸两端相距20cm处测得电位降为200V，则电场强度为200/20＝10V/cm。
纸上电泳根据电场强度的大小可分为常压(100～500V)纸上电泳和高压(2 000～10 000V)纸上电泳，前者电场强度一般为2～10V/cm，分离时间较长，从数小时到数天。后者电场强度为50～200V/cm，电泳时间很短；有时仅需数分钟。常压纸上电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，高压纸上电泳则多用来分离氨基酸，多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
2、溶液的pH值；溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值离等电点越远，则颗粒所带净电荷越多，泳动速度也越快，反之，则越慢。因此当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的pH，使各种蛋白质所带的电荷量差异较大，有利于彼此分开。为了使电泳过程中溶液pH值恒定，必须采用缓冲溶液。
3、溶液的离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势(ξ)，溶液的离子强度越高，电动电势越小，则泳动速度越慢；反之，则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。溶液离子强度的计算方法如下：
I??CZ2/2
式中：I为溶液的离子强度；C为离子的摩尔浓度；Z为离子的价数。
4、电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定方向移动，称为电渗现象。在纸上电泳中，由于纸上吸附OH-离子带负电荷，而与纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动，移动时可携带颗粒同时移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的泳动速度与由于电渗影响而被携带的移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动，则其表观速度将比泳动速度快，若原来向正极移动，则其表观速度将比泳动速度慢。
为了校正这一误差，可用一中性物质如糊精，蔗糖或葡聚糖等与样品平行作纸上电泳，然后将其移动距离自实验结果中除去。
5、滤纸的选择：要求纸质均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，使结果不能重复，并得不到好的图谱。如果吸附力大，则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被纸所吸附，以致于泳动快的部分其相对含量降低。因此常将滤纸事先处理，以减低滤纸的吸附能力，使达到更好的分离效果。若选用国产新华滤纸，或WhatmanNo.1号滤纸，一般不必再进行预处理。
6、其他因素：例如缓冲溶液的粘度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度的变化等因素，也都影响泳动速度。
本实验以混合氨基酸为材料，用纸上电泳法分离其中的不同氨基酸。 三、器材
水平式电泳槽、电泳仪、吹风机、点样器、喷雾器、铅笔、杭州新华滤纸或WhatmanNo.1
号滤纸 四、试剂
1、1/15mol/L磷酸盐缓冲液(离子强度0.08，pH6.0) 配制方法：
甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液（Na2HPO4 9.465g；蒸馏水加至1000mL） 乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液 （KH2PO4 9.07g；蒸馏水加至1000mL）
分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按1︰9比例混合，即可得所需pH的缓冲液。
2、1%丙氨酸、1%谷氨酸、1%赖氨酸标准溶液。
吸取上述氨基酸标准溶液各10mL于50mL烧杯中配成混合样品。 3、显色液（0.5%茚三酮丙酮溶液） 五、操作
1、仪器及样品的准备
将电泳槽洗净，晾干、放平。然后量取约700～800mL缓冲液先倒入电泳槽，使两端液面达到平衡。
2、滤纸的剪裁
用刀片将新华滤纸或WhatmanNo.1号滤纸，裁成长21.5cm，宽13.8cm的滤纸条，并按以下规格用铅笔作上正负记号。
剪裁前要选择纸质比较均匀的纸，用刀片裁整齐，注意纸边不能有缺刻或起毛，可先用废纸条练习，然后再正式裁剪。
3、点样
1）原点的位置和形状：对于一个未知样品，初次实验时，应将样品点在滤纸条的中央，观察区带的两极泳动情况，即可选择出点样位置。
样品可点成长条形，或圆点状。一般长条形分离效果较好，但样品很少时，点成圆点，样品比较集中，便于显色。但双向电泳或一向电泳、一向层析结合使用时则必须点成圆点或椭圆点，不能点成长条。
2）点样量：随滤纸的厚度，原点的宽度，样品的溶解度，显色方法的灵敏度，样品迁移率的差异而有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重，不能获得最有效的分离。样品量太少时，将无法检出。
3）点样方法：可分干点法和湿点法两种。
湿点法：先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液，或将滤纸浸于缓冲液中，浸透后取出，夹在两普通滤纸中，轻压，将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸重量比为1.2︰1～2.5︰1。然后架起滤纸，在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直，且粗细均匀，千万不可将滤纸画毛，损伤纸面。以湿点法点样品时，点的次数不宜多，因此如果样品浓度较低时，必须事先浓缩。
干点法：将样品点于纸上，待第一次样品晾干，再点第二次。画线必须细直，粗细均匀，直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥，而后小心地用喷雾器将滤纸两端喷湿，有样品处空出，让其缓冲液经扩散而自行湿润。或将滤纸除样品部分外浸于缓冲液中，放置片刻，样品部分靠毛细管作用而湿润，多余缓冲液用普通滤纸吸去。
干点法和湿点法各有利弊，干点法虽然在点样过程中起浓缩的作用，但点的次数多时，纸面容易受损，样品干坏。湿点法虽不宜用作稀的样品，却可保持样品的天然状态。
点样前，可用废滤纸条先以水代替样品进行练习，当操作熟练后再正式点样。 本次实验采用干法点样，在滤纸的中间位置横着划一直线，在直线上每隔2~3cm作一记号“×”，用毛细管分别吸取标准丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸各3uL及混合液10uL，小心点于滤纸上，点样直径不能大于0.5cm，每点一次用电风筒吹干，再点第二次，再吹干，直到点完。
4、电泳
将滤纸架放入电泳槽中，标有正号的一端应放在正极槽内，负号的一端放在负极槽内。并把滤纸条拉紧，使其成为平面，避免中间下垂。
盖上玻璃盖，关闭电泳槽中间活塞，检查好线路。然后打开电源开关，调整电压到250V左右，并观察或测量其电流数值，记下通电时间。
为了计算迁移率，要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压，记下读数。 5、烘干
通电0.5小时后，关闭电源开关，在滤纸与溶液交界处作上记号(以便测量长度l)，然后将滤纸条由滤纸架上取下，分别平插在具有两排细针的木架上放入105℃烘箱中烘干15分钟。或吹干。
6、染色 浸显色剂。
7、吹干至出现斑点。
8、绘出结果图，指出各斑点的氨基酸酸碱性质并说明你判断的依据。 六、思考题
1.A pI=9，B pI=11。设计一个最佳电泳分离方案。 2.电泳技术可否用于定量分析？
