实验服务 1 AFLP
1.1样品收集与运输
样品类型 植物材料 动物材料 DNA
样品要求
新鲜组织、叶片采用硅胶干燥后或干冰运输到实验室 新鲜组织，无水乙醇封存低温运输到实验室 干冰运输到实验室
注：AFLP涉及到酶切，DNA质量要求较高，客户应尽量提供新鲜样品
1.2 基本原理
AFLP（Amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点。同其它以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。 其基本原理是以PCR为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术，对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3’端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3’端严格配对的片段才能得到扩增，然后选择特定的片段进行PCR扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，本公司是用ABI377进行电泳检测。
1.3 技术路线
样品DNA 提取
酶切、连接 预扩增 选择性扩增 原始数据、01数据 ABI377电泳检测 数据分析 相似系数、聚类图 电泳图谱
1.4 相关试剂及配制 1）DNA提取试剂
2×CTAB提取缓冲液:
100mmol/L Tris.cl（pH＝8.0）,20mmol/L EDTA,1.4mmol/L Nacl，2％(W/V)CTAB,40mmol/L巯基乙醇。 1×CTAB沉淀液：
50mmol/L Tris.Cl（pH＝8.0），10mmol/L EDTA, 1%(W/V)CTAB, 20mmol/L巯基乙醇。 2）PCR扩增相关试剂
Taq 酶 （2u/μl） 鼎国自产 dntp (10MM) 鼎国自产 3）聚丙烯酰胺凝胶储液配制（4%） 尿素 152.1g （Sigma） 丙稀酰胺 17.2g （Sigma） 甲叉 0.6g （Sigma）
10×TBE 42ml 定溶到420ml
1.5相关仪器
1） 台式离心机 DGL-16
2） DG-II暗箱式紫外透箱仪 （鼎国自产） 3） DG-3D大型水平电泳槽 （鼎国自产） 4） DG-III双稳数显电泳仪 （鼎国自产）
5） Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA) 6） Sigma 3K18型低温冷冻离心机（Sigma ,USA） 7） ABI PRISM 377 sequencer 测序仪
1.6 实验结果
1）原始数据
公司为客户提供ABI377测序仪电泳检测后的片段大小，即原始数据。数据是通过GENESCAN这个软件进分析，软件每2个碱基读一次数，Marker片段范围为 70-500bp，这样在70-500 bp之间一共读取216个数，数据表如下图，由于不可避免的误差，在所设置的片段Bin Range范围内的片段，认为是同一条带，例如：在71.5-73.5 之间，c1 、c2扩增条带大小分别为73.00835 和71.9044，这样的误差范围在我们的误差
允许范围认为是同一条带。
2）01数据
在原始数据的基础上，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了01数据，同时给客户发一份所有01数据汇总后的总数据。
由于软件要求，我们一般都会给客户把数据处理成NTSYSpc2.1 这个软件要求的标准的01数据格式即01总数据。01总数据中 r1-r216 表示第一个引物，r217-r432 代表第二个引物和01分数据一一对应。例如：
一共有8个引物：a-1、a-2、a-3、b-1、b-2、c-1、d-1…….等，在总数据中按顺序排列： R1- r216 的数据为：a-1 这个引物的数据
R217-r432 的数据位：a-2 这个引物的数据……..，以此类推。
3）电泳图
公司为客户提供选扩增的全部电泳图谱，供客户参考
不加内标电泳图谱 加内标电泳图谱 4）聚类图 c10MW c1 c3 c13 c7 c16 c9 c11 c4 c14 c2 c12 c15 c21 c29 c6 c8 c22 c5 c17 c10 c30 c19 c24 c23 c25 c28 c26 c27 c18 c20 0.39 0.480.580.680.78Coefficient基于DICE相似系数的UPGMA个体间聚类图
5）相似系数
