易错警示 实验过程中两次洗涤的目的
α－淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验过程中，涉及两次对固定化酶柱的洗涤。第一次是α－淀粉酶固定时，目的是用于洗去未吸附的游离α－淀粉酶；第二次洗涤是实验结束时，对未反应的淀粉和产物的洗涤，目的是清除上述物质，以便于下次固定化酶柱的继续使用。两次洗涤过程，都使用10倍柱体积的蒸馏水对固定化酶柱进行洗涤。
题型一 微生物的培养与分离
1．(2016·江苏，25)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，下列相关叙述正确的是(多选)( )
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品 B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落 C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化 D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株 答案 BC
解析 漆酶降解“木质”，则漆酶菌株多存在于“木质”丰富的场所，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。
2．下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答下列问题。
A．配制培养基―→B.灭菌―→C.扩大培养(液体培养基)―→D.划线分离和培养(固体培养基)―→E.菌种保存
(1)A过程配制的是通用细菌培养基，称为________培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持______________。对培养基酸碱度的调节，应该在B过程的______(填“前面”或“后面”)。
(2)D过程与C过程相比，培养基中增加的物质是________________，E过程所需的温度是________。
(3)D过程后，一个菌体便会形成一个______________，这种分离方法是____________的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。
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(4)植物组织培养和微生物培养都需要无菌操作，下列不适宜用高压蒸汽灭菌的是( ) A．接种环和镊子 B．三角瓶和广口瓶 C．发芽培养基和生根培养基 D．用于培养的幼茎和幼芽
答案 (1)LB液体 渗透压 前面 (2)琼脂 4 ℃ (3)(单)菌落 消除污染杂菌(或纯化菌种) (4)D
解析 (1)LB液体培养基是通用的细菌培养基，LB固体平面培养基则用于划线分离形成单菌落。氯化钠的作用是维持培养基的渗透压。调节好酸碱度后才能进行灭菌，若灭菌后再进行酸碱度调节，又会产生新的污染。(2)在液体培养基的基础上加入一定量的琼脂可形成固体培养基。菌种应置于4 °C冰箱中保存。(3)通过划线分离后，一个菌体就会繁殖出一个菌落。(4)高压蒸汽灭菌常用于培养基、培养器材等的灭菌，而用于培养的幼茎和幼芽则不能进行任何灭菌操作，否则会导致细胞死亡。 题型二 分离以尿素为氮源的微生物
3．现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示： 土样→土壤浸出液→稀释→接种→培养、观察 请回答：
(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用________________进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布________个平板，通常以每个培养皿中有________个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
(2)接种后的培养皿________于37 ℃的恒温箱中培养。若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现____________，这是由于尿素被分解产生氨气，与该培养基中的___________产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基在成分上最主要的特点是____________。 (4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是(多选)( ) A．称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分 B．倒平板 C．涂布平板 D．微生物的培养
(5)与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)无菌水 3 20 (2)倒置 红色环带 酚红指示剂 (3)以尿素作为唯一氮源 (4)BC (5)土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量
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解析 (1)涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。(2)接种后需倒置培养皿恒温培养。含有脲酶的细菌能够将尿素分解，产生的氨气使培养基呈碱性，导致培养基中的酚红指示剂呈红色。(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源。(4)进行微生物培养和分离时，倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染。(5)尿素培养基只以尿素为氮源，在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。 4．要获得能够分泌脲酶的细菌菌种，某生物兴趣小组的同学设计了以下培养和筛选的途径： (1)获得菌种：要获得较多的能够分泌脲酶的细菌，最好取5～25 cm处的浅层土样，说明这类细菌的细胞呼吸方式为______________，在生态系统中属于__________________(成分)。 (2)将土样加入无菌水中配制成悬液，并配制如图所示的培养基，其中尿素在培养基中必须是作为保证微生物生长的唯一________________。向培养基中添加尿素的方法是待其他成分灭菌冷却后，加入尿素溶液，而该尿素溶液要事先用________________过滤，使之无菌。从物理性质看，该培养基属于____________。
葡萄糖：0.05 g NaCl：0.24 g K2HPO4：0.24 g 琼脂糖：1.0 g 酚红：0.5 g 水：30 mL 尿素：20 m 含2 g脲)
(3)利用酚红指示剂可检测出细菌是否能分泌脲酶，原理是脲酶能使_______________，结果菌落周围培养基呈红色。
(4)为获取能分泌脲酶的单菌落，必须将土壤样液进行稀释，并取少量稀释土壤液用____________接种于培养基上，培养皿在培养箱中培养时必须倒置，原因是______________。 (5)若要分离土壤中的尿素分解菌，对于采集和处理土壤样品，下列叙述错误的是( ) A．最好选择在肥沃湿润、动物排泄物多的土壤中取样 B．采集的土样需经高温灭菌后，才可以用于制取土壤稀释液 C．制备土壤稀释液时，要用无菌水
D．用于制备土壤稀释液的各种器具要经过灭菌
答案 (1)需氧呼吸 分解者 (2)氮源 G6玻璃砂漏斗 固体培养基 (3)培养基中的尿素分解为NH3，使周围的pH升高 (4)涂布分离法 防止冷凝后的水珠从皿盖上落入培养基，造成污染 (5)B
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分离以尿素为氮源的微生物的注意事项
(1)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶分解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。
(2)本实验中配制固体培养基时应选用琼脂糖而不能选用琼脂作凝固剂。这是由于琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固体培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。
(3)由于尿素在高温下会分解，所以对尿素溶液的灭菌要采用G6玻璃砂漏斗过滤的方法。并且应在基本培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至60 ℃时再加入。
(4)土样应从有哺乳动物排泄物的地方取得，这是由于动物排泄物中有一定量的尿素，在这些土壤中一般含有较多的分解尿素的细菌。 题型三 探究酶活性最适条件和用量的实验设计
5．(2016·温州中学检测)果胶酶能够催化果胶分解，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易，也使得浑浊的果汁变得澄清。请回答下列有关果胶酶的问题： (1)探究温度对果胶酶活性影响的实验步骤： a．用搅拌器制苹果泥；
b．取6个烧杯编号1、2、3、4、5、6，依次注入适量的30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的水，恒温水浴；
c．每一烧杯中放入两支试管，分别装有等量苹果泥和果胶酶，保温3 min；
d．向每组烧杯中的苹果泥试管中加入相应的等量的果胶酶，振荡试管，反应一段时间； e．过滤，比较获得苹果汁的体积。
①c过程中将苹果泥和果胶酶分别装在不同试管中，用相同温度恒温处理然后再混合，这样处理的目的是____________________________________________________。
②有人认为该实验缺乏对照，应补充一组果汁和蒸馏水相混合的实验，你认为有没有必要？________。原因是___________________________________________________________。 ③若继续探究果胶酶的最适用量，则在实验过程中温度、__________________________等因素应保持不变(列举两例)。
(2)有关果胶酶和纤维素酶的叙述，错误的是________。 A．二者都是蛋白质
B．催化果胶水解的酶是淀粉酶 C．二者都是在核糖体上合成的 D．构成纤维素酶的基本单位是葡萄糖
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