中国组织工程研究 第20卷 第28期 2016–07–01出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research July 1, 2016 Vol.20, No.28
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·研究原著·
骨髓间充质干细胞联合依达拉奉移植脑梗死大鼠血清炎性因子的表达 宋乃光，孙晶晶，张耀龙，孟令海，高书焕，薛 建，孙彩月(唐山市协和医院，急诊科，神经内科，河北省唐山市 063000)
引用本文：宋乃光，孙晶晶，张耀龙，孟令海，高书焕，薛建，孙彩月. 骨髓间充质干细胞联合依达拉奉移植脑梗死大鼠血清1
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炎性因子的表达[J].中国组织工程研究，2016，20(28):4162-4168.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.28.009 ORCID: 0000-0002-4105-602X(孙晶晶)
文章快速阅读： 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉有助于促进脑梗死损伤神经的恢复 尾静脉注射骨髓间评价指标： 充质干细胞悬液 mNSS评分 脑梗死 + ELISA检测 TTC染色 静脉滴注依达拉奉 半定量反转录PCR 文题释义：
依达拉奉：是一种自由基清除剂。大鼠在缺血/缺血再灌注后静脉给予依达拉奉，可阻止脑水肿和脑梗死的进展，并缓解所伴随的神经症状，抑制迟发性神经元死亡。机制研究提示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。
脑梗死：又称缺血性卒中，系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现。脑梗死依据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和腔隙性脑梗死等主要类型。
摘要
背景：抑制血清炎性因子凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物表达是治疗脑梗死的潜在靶点之一。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠血清炎性因子的表达变化。
方法：60只SD大鼠采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑梗死模型后，随机等分为模型组、骨髓间充质干细胞移植组和联合组。模型组连续 5 d尾静脉注射PBS，骨髓间充质干细胞移植组经尾静脉注射 2.0×109
L-1
骨髓间充质干细胞悬液1 mL，2次/d，连续 5 d。联合组静脉滴注依达拉奉30 mg+尾静脉
注射 2.0×109 L-1
骨髓间充质干细胞悬液1 mL(2次/d)，连续 5 d。
结果与结论：①与模型组相比，骨髓间充质干细胞移植组与联合组大鼠mNSS评分较低，血清凝血酶元激活因子的抑制因子1表达水平减少，脑梗死面积减少，脑组织中肿瘤坏死因子αmRNA的表达水平减少；②联合组大鼠上述指标变化差异比骨髓间充质干细胞移植组大；③结果提示骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉有助于促进脑梗死损伤神经功能的恢复。 关键词：
干细胞；移植；脑梗死；骨髓间充质干细胞；依达拉奉；血清炎性因子；凝血酶元激活因子的抑制因子1；组织纤维溶酶原激活物
主题词：
梗塞，大脑中动脉；间质干细胞；组织工程
Expression of serum inflammatory cytokines in rats with cerebral infarction
undergoing bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone
Song Nai-guang1, Sun Jing-jing2, Zhang Yao-long1, Meng Ling-hai2, Gao Shu-huan2, Xue Jian2, Sun Cai-yue2 (1Department of Emergency, 2Department of Neurology, Xiehe Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China)
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P.O. Box 10002, Shenyang 宋乃光，男，1981年生，河北省唐山市人，汉族，2005年华北煤炭医学院毕业，主治医师，主要从事神经内科急诊学方面的研究。
通讯作者：孙晶晶，硕士，主治医生，唐山市协和医院神经内科，河北省唐山市 063000
中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)28-04162-07 稿件接受：
2016-04-13
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110180
宋乃光，等. 骨髓间充质干细胞联合依达拉奉移植脑梗死大鼠血清炎性因子的表达
Song Nai-guang, Attending physician, Department of Emergency, Xiehe Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Corresponding author: Sun Jing-jing, Master, Attending physician, Department of Neurology, Xiehe Hospital of Tangshan, Tangshan 063000, Hebei Province, China
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Abstract
BACKGROUND: To inhibit the expressions of prothrombin activator inhibitor 1 and tissue plasminogen activator is one potential target for the treatment of cerebral infarction.
OBJECTIVE: To investigate the expressions of serum inflammatory cytokines in rats with cerebral infarction undergoing bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone. METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were enrolled to prepare models of focal cerebral infarction by middle cerebral artery occlusion, and were randomly divided into four groups. Rats were given intravenous injection of PBS via tail veins for 5 consecutive days as model group, rats were subjected to intravenous injection of 2.0×109 /L bone marrow mesenchymal stem cell suspension (1 mL) via tail veins, twice daily for 5 days as stem cell transplantation group, and those were given intravenous injection of 30 mg edaravone combined with intravenous injection of 2.0×109/L bone marrow mesenchymal stem cell suspension (1 mL) via tail veins for 5 days, twice daily, as combined group.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, modified neurologic severity scores were lower, expressions of serum prothrombin activator inhibitor 1 and tumor necrosis factor-α mRNA in the brain decreased, and the infarct area reduced in the stem cell transplantation and combined groups. And the changed levels of above indicators in the combined group were significantly larger than those of the stem cell transplantation group. In conclusion, combination of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation with edaravone can promote neural function recovery after cerebral infarction.
Subject headings: Infarction, Middle Cerebral Artery; Mesenchymal Stem Cells; Tissue Engineering
Cite this article: Song NG, Sun JJ, Zhang YL, Meng LH, Gao SH, Xue J, Sun CY. Expression of serum inflammatory cytokines in rats with cerebral infarction after bone marrow mesenchymal stem cell
transplantation combined with edaravone. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(28):4162-4168.
0 引言 Introduction
缺血性脑卒中以其高发病率、高致残率、高死亡率而严重威胁着人类的健康，因此缺血性脑卒中的治疗受到社会的广泛关注。临床中对于脑卒中的治疗主要以药物治疗为主，介入治疗和干细胞治疗相对较少
[1-7]
河北医科大学动物实验室完成。
1.3 材料 63只SPF级健康的SD大鼠，雌雄不限，鼠龄4.0-5.0周，体质量300-350 g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)20090028。大鼠实验期间自由饮水，饲养室温度18-28 ℃，相对湿度62%-80%。 1.4 方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养 取3只大鼠，采用颈椎脱臼处死，取大鼠四肢骨，充分暴露冲洗骨髓腔，收集冲洗液，吹打均匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入培养液，吹打至重新悬浮，取少量悬浮液接种到培养瓶中，培养1 d后更换新的培养液，每隔3或4 d换液一次。细胞融合至80%-90%时，可按1∶2比例进行传代。移植使用的细胞是第3或4代。
1.4.2 实验分组 将剩余60只SD大鼠采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑梗死模型，以腹腔注射5%水合氯醛将大鼠进行麻醉固定，首先依次分离并暴露大鼠右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，然后结扎并游离颈外动脉主干，用微血管夹夹闭颈总动脉及颈内动脉，用眼科剪在颈外动脉残端剪一小口，将直径0.23 mm、头端圆钝的日本鱼线经颈外动脉插入颈内动脉血管腔中，有阻力感时停止，即到大脑中动脉起始处；将线栓及颈外动脉残端一起结扎，缝合颈部切口。将大鼠放回笼中饲养观察。造模成功后随机分为3组：模型组、骨髓间充
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。
有研究显示血清炎性因子凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物的表达与脑梗死面积大小及预后密切相关
[8-9]
，所以抑制血清炎性因子凝血酶元激
活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物表达成为治疗脑梗死的潜在靶点之一。且研究显示，骨髓间充质干细胞移植可通过抑制血清炎性因子凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物表达，减少脑梗死面积及改善脑梗死的预后
[10]
。依达拉奉是临床上常用的一种
治疗缺血性脑卒中的药物，是一种羟自由基清除剂，可以减小脑梗死急性期患者梗死面积，减轻梗死后脑组织的水肿
[11-14]
。单独使用骨髓间充质干细胞移植及依达拉奉治疗
[15-21]
缺血性脑卒中时，脑梗死面积都可以减小且脑梗死的预后也可以得到一定程度的改善
，然而二者联合治疗对脑
梗死的作用是否优于单独使用其中一种，目前尚不明确。因此作者拟就二者联合治疗大鼠脑梗死的效果进行分析。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2014年1月至2015年8月在
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
宋乃光，等. 骨髓间充质干细胞联合依达拉奉移植脑梗死大鼠血清炎性因子的表达 www.CRTER.org
质干细胞移植组和联合组，每组20只。
1.4.3 干预 造模后当天进行干预。模型组尾静脉注射 2 mL PBS(武汉博士德生物工程有限公司)。骨髓间充质干细胞移植组经尾静脉注射2.0×109 L-1
骨髓间充质干细胞悬液1 mL，2次/d，连续5 d。联合组静脉滴注依达拉奉(武汉江民华泰医药化工有限公司)30 mg+尾静脉注射2.0×109
L-1
骨髓间充质干细胞悬液1 mL(2次/d)，连续5 d。 1.4.4 mNSS评分 移植后第1，3，7，14天进行mNSS评分。mNSS评分主要通过对大鼠运动、感觉、平衡、反射的评价来判断大鼠神经功能的缺损及恢复情况。神经功能共分为0-18分，分值不同代表神经功能的受损的严重程度不同，0分表示神经功能正常，没有受损，18分则表示神经功能严重缺失
[22]
。
1.4.5 ELISA检测 采用ELISA法来检测血清炎性因子凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物的表达量。移植后第2周，大鼠尾静脉采血3.0-4.0 mL，静止放置30-35 min后，3 200 r/min离心5 min，取上清液，-80 ℃储存，ELISA法(上海酶联生物技术有限公司)检测凝血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物的表达水平。
1.4.6 TTC染色 移植后2周，大鼠水合氯醛腹腔注射麻
醉，断头处死，取脑，生理盐水冲洗后置于-20 ℃冷冻 10 min后，沿冠状面切片，切片厚度为2 mm，2%TTC溶液(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)染色约 10 min，红色为正常脑组织，苍白色为梗死脑组织，采用病理图像分析仪(徐州市技易软件科技有限公司)计算梗死面积。
1.4.7 半定量反转录PCR检测肿瘤坏死因子α mRNA的表达水平 移植后2周，采用改良的异硫氰酸胍一步法抽提大鼠脑组织中总RNA(华舜公司)，采用一步法RT-PCR检测脑组织中肿瘤坏死因子α mRNA表达(大连宝生物公司试剂盒)。肿瘤坏死因子α及β-actin序列由上海生工公司合成。肿瘤坏死因子α：正义链5’-GCCAAT GGC ATG GAT CTC AAA G-3’，反义链5’-CAG AGC AAT GAC TCC AAA GT-3’，扩增产物为357 bp。β-actin：正义链5’-GTG GGC CGC TCTAGG CAC CAA-3’，反义链5’-CTC TTT GAT GTCACG CAC GAT TTC-3’，扩增产物为540 bp。50 ℃ 30 min反转录反应，94 ℃ 2 min灭活反转录酶。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，72 ℃终末延伸10 min。将少量扩增产物置于1.8%琼脂糖凝胶中电泳。然后以目的基因与β-actin的灰度比值代表肿瘤
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坏死因子α的表达水平。
1.5 主要观察指标 大鼠mNSS评分、血清炎性因子表达水平、脑梗死体积以及脑组织中肿瘤坏死因子α mRNA的表达水平。
1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件包进行处理。所有实验数据以x_
±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 骨髓间充质干细胞的形态 分离培养两三天时可见细胞形成多个集落，呈多角形或长梭形，有明显集落生成。传代3次后的骨髓间充质干细胞形态趋于一致，胞体饱满。显微镜下可见骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达97%以上，见图1。
A B
图1
骨髓间充质干细胞的形态 (×200)
Figure 1 Morphology of bone marrow mesenchymal stem
cells (× 200) 图注：图中 A为培养两三天的骨髓间充质干细胞，生长放缓；B为传代第 3次的骨髓间充质干细胞细胞呈长梭形，生长良好。
2.2 实验动物数量分析
60只大鼠均进入结果分析。 2.3 mNSS评分 与模型组相比，联合组和骨髓间充质干细胞移植组大鼠的mNSS评分较低(P < 0.05)，且联合组大鼠的mNSS评分低于骨髓间充质干细胞移植组(P < 0.05)。提示联合干预较单独移植骨髓间充质干细胞能更好的促进神经功能的恢复(表1，图2)。
表1 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠
mNSS评分的影响 (x_
±s，n=20) Table 1 Modified neurologic severity scores of rats with cerebral infarction undergoing bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone
组别 模型组 骨髓间充质 联合组
干细胞移植组 移植前 12.03±0.10 12.20±0.14 12.54±0.12
移植后3 d 11.69±0.08 10.36±0.04a 9.12±0.09ab 移植后7 d
11.31±0.21 9.64±0.20a 7.15±0.18ab 移植后14 d 10.72±0.17
6.31±0.12a
4.02±0.15ab
表注：与模型组相比，a P < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相比，
bP < 0.05。
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表2 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠血
清炎性因子表达水平的影响 (x_
±s，n=20，mg/L) Table 2
Expressions of serum inflammatory cytokines in rats with cerebral infarction after bone marrow
mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone
组别 凝血酶元激活
组织纤维溶酶
因子的抑制因子1 原激活物 模型组
0.77±0.05
0.21±0.14 骨髓间充质干细胞移植组
0.42±0.07a
0.36±0.19a
联合组
0.26±0.02ab
0.47±0.10ab
表注：与模型组相比，aP < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相比，
b
P < 0.05。
模型组 骨髓间充质干细胞移植组 联合组
15 a 分10 ab a 评 Sab Sa N m5 ab 0
移植前 移植后3 d 移植后7 d 移植后14 d 图 2 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠
mNSS
评分的影响
Figure 2 Modified neurolgic severity scores of rats with
cerebral infarction after bone marrow mesenchymal stem cell
transplantation combined with edaravone
图注：与模型组相比，a
P < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相
比，bP < 0.05。
模型组 骨髓间充质干细胞移植组
8 联合组 7 的)L6 a ab 子/g 因m5 a (性平4 炎水清达3 ab 血表2 1 0
凝血酶元激活 组织纤维溶酶 因子的抑制因子1 原激活物
图 3 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠血清凝
血酶元激活因子的抑制因子1和组织纤维溶酶原激活物表达水平的影响
Figure 3 Expressions of prothrombin activator inhibitor 1 and
tissue plasminogen activator of rats with cerebral infarction after
bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined
with edaravone
图注：与模型组相比，aP < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相
比，
b
P < 0.05。
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
表3 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠脑
梗死面积的影响 (x_
±s，n=20) Table 3 Effect of the combination of bone marrow
mesenchymal stem cell transplantation with edaravone on the infarction area of rats with cerebral infarction
组别 脑梗死面积(%) 梗死体积百分比(%)
模型组 12.77±0.15 6.210.04 骨髓间充质干细胞移植组 6.42±0.17a
2.36±0.19a 联合组
3.26±0.02ab
0.47±0.10ab
表注：与模型组相比，aP < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相比，
b
P < 0.05。
模型组 骨髓间充质干细胞移植组
15 联合组 10 a 5 ab a ab 0
脑梗死面积(%) 梗死体积百分比 (%) 图4 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠脑梗死
面积的影响
Figure 4 Effect of the combination of bone marrow
mesenchymal stem cell transplantation with edaravone on the infarction area of rats with cerebral infarction
图注：与模型组相比，aP < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相比，bP < 0.05。
骨髓间充质
模型组 干细胞移植组 联合组
肿瘤坏死因子α β-actin
1.00
与 ()平值 水比0.75
达的表度 a
α光子吸0.50
ab
因的 死ni坏tc0.25
瘤a-肿β 0
模型组 骨髓间充质 联合组
干细胞移植组
图5 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉对脑梗死大鼠脑组织中肿瘤坏死因子α表达水平的影响
Figure 5 Expression of tumor necrosis factor alpha in rats with cerebral infarction after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone
图注：与模型组相比，aP < 0.05；与骨髓间充质干细胞移植组相比，bP < 0.05。
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