Nrf2/ARE通路在抗病原生物感染中的作用
研究进展
欧广利 综述；朱翠明 审校
南华大学医学院病原生物学研究所，湖南 衡阳 421001
摘要： 氧化应激反应是病原生物感染并致病的重要环节,病原生物感染可诱导宿主细胞产生大量的活性氧（ROS）或直接激活Nrf2/ARE通路，产生一系列保护性蛋白，保护宿主细胞抵抗氧化应激损伤。转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）是宿主细胞调节抗氧化应激的一种关键转录因子，可与抗氧化反应元件（ARE）相互作用，诱导抗氧化酶/Ⅱ相解毒酶基因的表达，从而在细胞保护防御中发挥重要作用。Nrf2的表达活性与病原生物感染密切相关，本文将综述Nrf2/ARE通路在抗病原生物感染中的最新研究。 关键词：Nrf2/ARE通路；抗感染；病原生物
中图分类号：R392.11 文献标志码：A 文章编号：1005-5673（2014）
Advances in protective role of Nrf2 / ARE during pathogenic infection
OU Guang-li, ZHU Cui-ming
Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421000, Hunan Prouince , China
Corresponding author: ZHU Cui-ming，E-mail: cuiming_zhu@yahoo.com.cn
Abstract： Nuclear transcription factor E2-related factor 2 (Nrf2) is a key regulator in antioxidant defense response in host cells. Nrf2 shares in common a cis-acting enhancer sequence termed antioxidant response element (ARE) that includes antioxidant enzymes and phase Ⅱ detoxifying enzyme, which play an important role in cell protection. Oxidative stress is an important part of the pathogenic infection. Pathogen infection can activate Nrf2 / ARE signaling pathways to develop the product directly or by inducing host cells for reactive oxygen species (ROS), leading to a increasing expression of protective protein and protect the host cell from oxidative damage. The expression of Nrf2 has a cruicial relationship with pathogen infection, this article will review the Nrf2 / ARE pathways in the latest research of anti- pathogen infection. Keyword： Nrf2/ARE pathway; Anti-infection; Pathogen
核因子相关因子2( Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)是调控抗氧化应激的一种关键转录因子，并广泛表达于人类所有组织。Nrf2通过与抗氧化反应元件（Anti-oxidative response element，ARE）相互作用，启动下游抗氧化酶基因等细胞保护性基因的转录，从而在抗氧化应激的适应性反应中发挥重要作用。Nrf2/ARE通路在抗炎症反应、抗凋亡、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化及调节心脑血管反应、调节谷胱甘肽（GSH）合成、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护作用，已成为病原生物学研究的热点之一，本文将重点阐述Nrf2/ARE在抗病原生物感染方面的研究进展。
1 Nrf2/ARE通路的分子基础
Nrf2是属于 Cap‘n’Collar(CNC)蛋白调节家族的碱性亮氨酸拉链（Basic leucine zipper, bZIP）转录因子，人类Nrf2基因位于2q31,含有605个氨基酸，包括6个不同的功能区，分别被命名为Neh1到Neh6，Nrf2的亮氨酸拉链结构位于Neh1区，bZIP和小Maf蛋白形成异源二聚体并与抗氧化反应元件结合的区域。Neh2能与胞浆蛋白Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）结合并受其负性调控。Neh3区是Nrf2与染色质重构蛋白CHD6结合的区域，可辅助激活ARE相关基因的转录。Neh4和Neh5是位于Neh1和Neh2之间
基金项目:国家自然科学基金（81072418/H1005）资助
作者简介:欧广利（1989-），女，硕士，主要从事支原体免疫机制。 通讯作者:朱翠明，E-mail: cuiming_zhu@yahoo.com.cn
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的两个激活区，Neh4和Neh5分别与CBP[CREB (cAMP Responsive element binding protein) binding protein]相互结合可激活Nrf2目标基因转录活性。而Neh6区与Neh2区共同调节Keap1对Nrf2的负性调控。
在正常生理条件下，Nrf2与肌动胞浆蛋白Keap1结合，以Keap1的甘氨酸重复区域与Nrf2的N端Neh2结构域结合成的二聚体形式存在于细胞质中[1]， Keap1通过与Cul 3发生作用成为E3泛素化连接酶复合物，使得Nrf2被泛素蛋白酶体途径迅速降解 [2]。外界氧化应激因子和亲核物质刺激，或Nrf2磷酸化均可导致Nrf2与Keap1解离，解离后的Nrf2转位至细胞核，与小Maf、JunD、c-Jun、ATF4结合成异二聚体，然后与ARE启动子部位结合，启动下游编码II相解毒酶/抗氧化酶基因即谷胱甘肽硫转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、NADPH醌氧化还原酶（NQO1）、环氧化物水解酶（EPHX）、γ谷氨酸合成酶重链（γＧＣＳ-h）和轻链（ γＧＣＳ-L）以及血红素氧化酶1（HO-1）等的表达[3-4]。因此，通过阻止Nrf2与Keap1结合、减弱Keap1介导的泛素蛋白酶体途径对Nrf2的降解作用、促进Nrf2向胞核中转移均可以激活Nrf2/ARE通路。目前认为促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、磷脂酰肌醇-3-肌醇（PI3K）和蛋白激酶C（PKC）等几条蛋白激酶途径在Nrf2-ARE通路激活及其相关基因表达的调控方面起着重要作用[5]。此外，内质网激酶非折叠蛋白的蓄积可通过胰腺内质网激酶（PERK）直接磷酸化Nrf2而激活Nrf2 [6] 。还有研究提出存在一个不依赖Keap1降解Nrf2的新途径， 即通过糖原合成酶激酶-3β（GSK- 3β）磷酸化Nrf2的Neh6结构域中的丝氨酸残基，磷酸化的Nrf2随后从细胞核中移出，被泛素蛋白酶体途径迅速降解[7]。
目前认为Nrf2-ARE信号通路是通过翻译后蛋白修饰调控的，但是一些新证据表明表观遗传和基因多态性可调节Nrf2启动子的转录活性[8-9] 。
2 Nrf2/ARE通路在抗微生物感染方面的研究
2.1 抗细菌感染
败血症是由多种致病菌或条件致病菌引发的感染性疾病, Nrf2是败血症的新型调节因子，它通过调节机体的固有免疫来提高败血症患者的存活率[10]。研究表明，Nrf2-/-小鼠对LPS诱导的感染性休克比野生型小鼠更敏感。当暴露于致死剂量的LPS时，Nrf2-/-小鼠比野生型小鼠病死率高[11]。此外，Nrf2-/-小鼠即使在CO(Nrf2依赖性HO-1诱导剂)环境中对金黄色葡萄球菌败血症也比野生型小鼠更敏感。用CO处理的野生型金黄色葡萄球菌败血症小鼠，Nrf2和AKT信号通路被激活，它的存活率比Nrf2-/-小鼠高[12]。多器官功能衰竭综合征是由败血症引发的高度致命的并发症，而线粒体损伤是多器官功能衰竭的重要环节，HO-1通过Nrf2可部分调节线粒体的质量监控。根据文献报道，Nrf2调控的HO-1可调节线粒体的生物合成，以抵抗败血症引起的炎症反应从而提高败血症患者的存活率 [13]。因此，Nrf2/HO-1调控的线粒体的生物合成在抗败血症中发挥重要作用。
幽门螺杆菌感染，可引起胃粘黏膜产生慢性氧化应激反应，从而产生胃黏膜损伤，增加患胃癌的风险，而幽门螺杆菌蛋白被认为是能诱导胃上皮细胞发生肿瘤转移的重要因素。研究表明，当幽门螺杆菌的CagA和HspB两种蛋白共同转染或单独转染至AGS细胞时， HO-1、SOD-1和NQO-1的基因表达增强[14]，而这些蛋白的表达受Nrf2/ARE通路的调控。
结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。肺结核患者体内氧化应激标志物的水平较高且抗氧化剂如维生素C、E和谷胱甘肽的消耗增多[15]。根据最近的文献报道，在肺结核的豚鼠模型中由氧化应激诱导的肺部和脾脏病变增多，并且在这些小鼠体内存在大量的氧化应激标志物。感染结核分枝杆菌的细胞内Nrf2表达水平升高，但是由于表达的Nrf2主要分布于胞浆中，因此使得ARE介导的Ⅱ相解毒酶的表达水平降低[16]。由此可见，Nrf2在抗结核分枝杆菌感染诱导的氧化应激损伤中发挥了关键性的作用。
发酵支原体感染可激活单核/巨噬细胞系统的细胞从而释放多种促炎性细胞因子，如白细胞介素-1β
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（IL-1β），TNF-α，一氧化氮(NO)，还可通过旁路途经激活补体系统，导致宿主细胞产生炎症反应。巨噬细胞活化脂肽（MALP-2）是新近发现的发酵支原体细胞膜上的一种脂多肽,它可刺激免疫系统产生多种炎症介质,如细胞因子和环氧酶2(COX-2)等，而这些炎症介质对支原体感染引发炎症反应的发病机制起着至关重要的作用。HO-1是血红素代谢的限速酶，可保护细胞免受炎症和氧化应激导致的损伤，MALP-2可通过MAPKs和Nrf2/ARE通路诱导HO-1的mRNA及其蛋白的表达[17]，HO-1可保护宿主细胞免受发酵支原体感染引发的炎症及氧化应激所致的损伤。据文献报道，HO-1基因在其5’非翻译区有很多应激活化反应元件，其中包括AREs[18]，而ARE诱导抗氧化蛋白的表达以及调节不同刺激引发的炎症反应都与Nrf2密切相关
[19-20]
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2.2 抗病毒感染
乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染引发的慢性炎症不仅诱导肝细胞产生氧化应激反应，而且还诱导抗氧化反应。根据Schaedler等的报道，HBV感染可诱导Nrf2调控的细胞保护基因的表达，从而保护感染HBV的细胞免受氧化应激介导的细胞损伤[21]。Ivanov等人的研究表明，HCV感染可诱导产生大量的活性氧( Reactive oxygen species, ROS),同时也高度诱导产生抗氧化反应[22]。但是也有研究表明，赤芝酮可通过Nrf2介导的血红素氧化酶的表达抑制HCV复制[23]。赤芝酮是一种由红果山胡椒分离出并可抑制HCV复制的化合物，它可以高度诱导HO-1的表达，产生大量的胆绿素，进而诱导抗病毒干扰素反应并抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性。HCV感染肝细胞后，赤芝酮可刺激肝细胞激活Nrf2，使得胞质中的Nrf2从Keap1中解离，转移至胞核中，胞核中的Nrf2通过Mafs蛋白与ARE相互作用，激活Nrf2/ARE通路下游HO-1基因的表达，从而产生大量的胆绿素，最终抑制HCV的复制。因此，Nrf2/ARE通路在抗HCV感染及抑制病毒复制方面发挥着重要作用。
流感病毒是引起呼吸道感染最常见的病原体，根据流感病毒RNP和M蛋白的抗原性不同，分为甲、乙、丙三种类型,最常见的是甲型流感病毒，因为甲型流感病毒的变异性最强。流感病毒感染可引起肺部炎症和氧化损伤。有研究表明，用香烟烟雾处理的小鼠，Nrf2介导的抗氧化应激反应可抵抗流感病毒感染引起的肺部炎症及其氧化应激损伤[24]。流感病毒H1N1感染肺泡上皮细胞可诱导细胞产生大量的ROS,并激活细胞内Nrf2，HO-1，MX-1和OAS1的表达，并促进Nrf2向胞核中转移。用siRNA技术敲除Ⅱ型肺泡上皮细胞的Nrf2基因后，细胞对流感病毒H1N1感染诱导的炎症及其损伤更敏感，而用Nrf2的腺病毒载体干扰Ⅱ型肺泡上皮细胞后， Nrf2在细胞中的表达增多,细胞的炎症损伤减少。H1N1感染Ⅱ型肺泡上皮细胞后激活细胞表达Nrf2，从而抑制病毒的复制，降低H1N1核蛋白的表达，减少氧化应激反应[25]。
呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原体，感染后常诱发肺炎和毛细支气管炎。RSV感染呼吸道细胞后诱导细胞产生大量的ROS，从而导致氧化应激反应。而且 RSV感染高度诱导Nrf2和ARE相应基因的表达与活性。据Castro等的研究表明，用 Nrf2/ARE通路的诱导剂丁基羟基茴香醚处理小鼠， RSV感染诱导的肺部炎症明显受到抑制，且清除病毒的能力也明显增强[26]。此外，比起Nrf2+/+小鼠，Nrf2-/-小鼠感染RSV之后引发的炎症反应更严重，体内的抗体滴度更高，黏液分泌增多更显著，上皮细胞损伤也更严重。而且用有效的Nrf2/ARE通路诱导剂预处理感染RSV的Nrf2-/-小鼠后显著减弱了肺部RSV病毒载量和早期炎症反应。根据文献报道，Nrf2/ARE通路介导的抗氧化途径通过上调抗氧化酶表达，增强清除病毒的能力，减少炎症介质来保护小鼠呼吸道细胞免受RSV感染引起的损伤[27]。因此，以Nrf2/ARE通路介导的抗氧化应激作用不仅可以降低肺部RSV的传染性，而且还为RSV感染性疾病提供了一个潜在的新的治疗方法。
疱疹病毒感染的宿主范围广，并有潜伏感染趋向，严重威胁人类的健康。疱疹病毒的种类较多，这里阐述单纯疱疹病毒（HSV）和人巨细胞病毒（HCMV）感染与Nrf2/ARE通路的相互关系。HSV是一类严重
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危害人类健康并引发人类多种疾病的常见病原体。目前，对Nrf2在HSV感染中的作用的文献报道很少，但最近有研究表明HSV感染激活了MAPK信号通路，从而诱导免疫细胞分泌大量的促炎性细胞因子并激活NADPH氧化酶产生大量的ROS,从而诱导产生氧化应激反应。然而，HSV感染也激活了Nrf2/ARE通路，产生抗氧化剂HO-1和谷胱甘肽过氧化物酶以抵抗氧化应激反应[28]。
人巨细胞病毒引起以生殖泌尿系统、中枢神经系统和肝脏疾病为主的各系统感染，从轻微无症状到严重感染至死亡。根据文献报道，HCMV感染人的原代包皮成纤维细胞(HFFs)后Nrf2及其下游的HO-1基因的表达均上调，而且抑制Nrf2表达的短发卡RNA(shRNA)可以抑制HFFs表达HO-1。当HCMV经紫外线消毒或其蛋白激酶CK2的活性被抑制时，HCNV诱导的Nrf2表达受到抑制。在氧化应激状态下,感染HCMV的宿主细胞比未感染HCMV的细胞的存活率高，由此说明HCMV感染可能诱导细胞产生一种保护作用，但是实验证明，抑制Nrf2表达的shRNA可消除这种保护作用。综上所述，HCMV感染宿主细胞可诱导激活Nrf2/ARE通路 ，从而帮助宿主细胞抵抗病毒感染或炎症诱导的氧化应激反应[29]。 2.3 抗寄生虫感染
Nrf2/ARE通路在抗寄生虫感染方面也有重要作用。Nrf2调控的过氧化物酶体增殖物激活受体（γPPARγ）独立信号通路可以诱导清道夫受体CD36的表达上调，而CD36能特异性识别感染了疟原虫的红细胞。疟疾患者体内感染了恶性疟原虫的巨噬细胞，其CD36的表达减少，从而导致CD36介导的对感染红细胞的吞噬作用减弱。此外，感染了恶性疟原虫PPARγ-/-的巨噬细胞在用Nrf2诱导剂处理之后可使其恢复吞噬寄生虫的功能，使疟疾的治疗效果得到明显改善[30]。此外，Nrf2在抗克氏锥虫感染以及抗线虫感染方面也有重要影响[31]。 2.4 抗真菌感染
由于长期应用光广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、放疗或化疗后以及获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者真菌感染近年来逐渐增多。从裂蹄木层孔菌提取出的正丁醇亚组分（PL）经HO-1调节其抗炎活性，根据研究表明，PL可通过蛋白激酶Cδ诱导ARE基因的表达上调，而HO-1是由ARE调控的细胞保护基因。此外，在巨噬细胞中Nrf2的表达上调可增强PL对ARE基因表达的激活作用，而Keap1可抑制PL的这种激活作用。因此，PL是经Nrf2/ARE通路诱导HO-1的表达从而保护细胞抵抗应激损伤[32]。
据文献报道，从接触曲霉菌疫的大豆中提取的大豆抗毒素是通过Nrf2诱导Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达[33]。从酱油曲霉中提取的大豆抗毒素不仅与许多Ⅱ相解毒酶有相同结构特征，而且还具有抗氧化活性，它可促进Nrf2向胞核中转运，从而激活解毒酶以及抗氧化酶基因的表达。
3 结语
Nrf2/ARE通路在不仅在抗氧化应激中有发挥重要作用，而且对固有免疫系统也发挥有重要影响。Nrf2/ARE通路既可以增强宿主对病原生物的清除能力，也能保护宿主免受感染引发的炎症及氧化应激反应所致的损伤。因此, Nrf2/ARE通路可帮助宿主抵抗病原生物感染，并减少氧化应激诱导的细胞毒性和细胞凋亡。综上所述，Nrf2/ARE通路的调节与传统的抗生素治疗结合，可能对将来病原生物感染的防治起较大的作用。
参考文献
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