2、
六、注意事项
式中理论含量3.5g/100mL牛奶
1、离心机的使用安全：（1）使用前，离心管和离心物一定要对称平衡；（2）离心开始时，设置好了转速和时间，一定要等到转速稳定了后，人才能离开；（3）离心结束，只有仪器报警了，且转速完全为零后，才能打开离心机盖。 七、思考题
1、酪蛋白的理化性质
2、酪蛋白的生物学功能有哪些？
实验六 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度
一、目的
1、学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 2、掌握标准曲线定量分析方法 3、熟练掌握分光光度计的使用方法 二、原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 三、材料、主要仪器和试剂
1．仪器：分光光度计（配玻璃比色皿、擦镜纸、注明废液回收的具塞广口瓶、洗瓶）
2. 玻璃器皿：0.1 mL、1 mL刻度吸管各2支（配合适大小吸耳球）；10 mL具塞具刻度试管10支（应干净干燥，放到试管架上）；100 mL烧杯2个，10 mL量筒1个；玻璃棒1根；长胶头滴管1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。 3．试剂： （1）~（3）由实验员配制，贴好标签。
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％
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乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）0.9%NaCl
（4）样品贮备液：实验五所得粗蛋白碱水溶液 四、操作步骤 1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。 表1 低浓度标准曲线制作
（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL 的标准曲线。 表2 高浓度标准曲线制作
2．样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：将样品贮备液用0.9%NaCl合适稀释至可测定范围，即得待测样品水溶液。
（2）测定：另取2 支10mL 具塞 试管 ，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595 nm，
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并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1 号试管做空白。
五、结果计算 1．绘制出标准曲线 2．含量的计算
式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
若样品溶液经过稀释，则最后结果要乘以稀释倍数。 六、注意事项
1．蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。
2. 制作标准曲线及测定样品时，要将各试管中溶液纵向倒转混合，目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。 七、思考题
1． 蛋白质浓度可以用哪些方法测定？
参考答案：蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收、折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin酚试剂反应等方法来计算；也可以用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝法测定；还可以用荧光激发法、氰胺、放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。
实验七 酵母RNA的提取
一、实验目的：
1、掌握RNA的理化性质
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2、掌握稀碱法提取RNA的原理与技术。 二、实验原理：
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA（本实验）或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。酵母含RNA达2.67~10.0%，而DNA含量仅为0.03~0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。结合实验八得到RNA浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出RNA含量。 三、实验用品： 1．仪器：
电子天平（0.00g，配称量纸）；离心机（5000r?min-1，配离心管）；水浴锅或可控温加热设备 2. 玻璃器皿
100ml烧杯1个；10ml量筒3个；长胶头滴管3支；玻璃棒1根。此部分为每组所用，放置各实验台上。
3．试剂：（2）由实验员配制，贴好标签。 （1）干酵母粉（市售）
（2）0.2%氢氧化钠溶液：2gNaOH溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 （3）乙酸（A?R）。 （4）95%乙醇。 4. 其它
pH试纸（pH1~10）；滤纸；纸巾若干；标签纸若干。 四、操作步骤：
置1g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10―15分钟（4000r?min-1）。取上清液，加入95%乙醇8ml，边加边搅。加毕，静置，离心。用胶头滴管吸去上清液，沉淀再用95%乙醇洗2次（每次约2.5ml），洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。沉淀即为粗RNA，将其用蒸馏水溶解后定容，贴好标签，保存至冰箱中，用于实验八。 五、实验结果与讨论
1、观察产品颜色是否与理论相符，若不符合，分析原因。 2、结合实验八计算含量 六、注意事项
1、沉淀有时出现较慢，可多放置一些时间。
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