第4期
沈延等: TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 541 2.4 TALEN活性检测与斑马鱼突变体筛选 2.4.1 TALEN体内活性检测(以斑马鱼为例)
这一步首先通过体外转录合成编码TALEN的mRNA, 再将成对的mRNA显微注射到斑马鱼单细胞受精卵中, 2~4 d后提取基因组DNA, 采用限制性内切酶酶切法检测TALEN位点是否发生突变, 同时可以估算TALEN的突变效率。这一步也可以选用直接克隆测序等其他方法代替酶切检测。
(14)线性化TALEN表达载体：通过NotⅠ或 SacⅡ酶切线性化鉴定正确的pCS2-TALEN载体对(需
要先确认一下NotⅠ或SacⅡ为单一酶切位点)。线性化完全后可直接用快速DNA产物纯化试剂盒回收。
(15)体外转录TALEN mRNA(SP6, Ambion)、回收, 溶于20~30 μL DEPC H2O中, Nanodrop定量。
(16)将左、右两侧半位点的一对TALEN mRNA混和, 显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中[18], 得到F0胚胎(注射量建议：50~150 pg/半位点)。同时留一些未注射的同批胚胎作为对照。
(17)取2~4 dpf注射后表型正常的胚胎, 1~5个胚胎为一组, 提取基因组DNA, PCR扩增靶点周围的序列(最好用“2.2.2”中鉴定过的引物)。
(18)酶切检测TALEN在靶点造成的突变。如果有完整的、未切开的PCR条带(前提是未注射的对照胚胎的PCR产物能够全部被切开), 则说明靶点可能发生了突变。将未切开的条带切胶回收, 连入T载体, 测序鉴定靶点的突变情况(图8)。未切开的PCR条带占所有条带的荧光亮度的百分比可大致反映TALEN的突变效率。
图6 pCS2-TALEN载体及酶切位点示意图
【示例5】TALEN终载体的酶切检测结果分析(图
7, 表4)：
图7 pCS2-TALEN载体酶切鉴定结果示例
表4 TALEN终载体酶切、电泳后的各种情况分析
电泳 酶切产物 编号 (大约的kb数)
质粒类型(以15个TALE单元为例)
及判断结果
TALE重复序列正向接入 (√) 1 5+2
pCS2-FokI空载体 (×) 2 5+0.5
TALE重复序列反向接入 (×) 3 6.5+0.5
未接入完整的TALE重复序列(=断连) (×)4 5+ <2 多个TALE重复序列串连接入(=串连) (×)5 5+ >2
【示例6】BamHⅠ酶切检测tnikb位点的突变情况(图8)：
图8 tnikb TALEN位点indel突变检测结果
PCR：未经酶切的PCR产物; 对照：对照组胚胎(未注射TALEN mRNA)PCR产物酶切后的结果; +TALEN：实验组胚胎(注射了TALEN mRNA)PCR产物酶切后的结果。此例中TALEN的突变效率约为12%。
542 HEREDITAS (Beijing) 2013
第35卷
2.4.2 斑马鱼TALEN突变体筛选
这一步首先是检测F0(Founder)外交得到的F1
胚胎, 以便筛选出生殖细胞中带有(可遗传的)靶位点突变的F0成鱼。将这样的F0成鱼外交得到的后代(F1)养大, 再通过剪尾逐条检测F1的靶位点序列, 即可筛选出携带可遗传TALEN突变的斑马鱼个体。
(19)将TALEN活性>1%(最好能>10%, 这样更便于筛选)、存活率较高(不低于70%)的同批F0胚胎饲养至性成熟(一般电泳结果中肉眼可见未切开的条带即可认为TALEN活性>1%)。
(20)与野生型(WT)成鱼外交, 收集F1胚胎。每条F0建议检测20个以上的F1胚胎。
(21)将每3~5个F1胚胎混和为一组, 提取基因组DNA, 对TALEN位点进行PCR扩增和酶切、电
泳检测。
(22)回收未切开的条带(携带潜在突变的PCR产物)进行测序鉴定。选取F1胚胎发生 突变的F0鱼外交, 大量饲养F1。
(23)剪尾鳍提取F1的基因组DNA, 逐条进行基因型分析(=通过PCR、酶切、测序检测靶位点序列)(图9)。
(24)选取携带感兴趣的TALEN突变的、成对的F1斑马鱼, 通过内交进行表型分析; 如果不成对, 则可外交后选取成对的F2杂合子, 再通过内交分析表型。做过原位杂交的胚胎仍然可以用常规方法提取基因组DNA, 用于PCR鉴定。因此, F1或F2杂合子内交得到的胚胎做过原位杂交检测后, 可以提取基因组DNA, 然后通过PCR和酶切的方法进行基因型分析。
【示例7】BamHⅠ酶切检测F1成鱼中tnikb位点的基因型(图9)：
图9 酶切检测tnikb位点的基因型
3 常见问题和注意事项
3.1 TALEN靶点选择需要考虑的其他问题
(1)靶位点选择因基因而异, 一般而言, 靶点靠前比较好, 尽量在基因编码序列(CDS)的前2/3, 但是要在ATG之后, 这样突变等位基因(Allele)可编码的多肽产物较短, 更接近无效突变(Null mutation)。同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框(in-frame)的起始密码子。
(2)靶点也可选择在内含子和外显子的交界处, 以破坏靶基因的剪接。
(3)还要注意靶基因是否有多个不同的剪接变体或转录变体, 注意需要突变的是某一个剪接变体或转录变体, 还是所有的剪接变体或转录变体。
3.2 关于TALEN的脱靶效应
关于TALEN的脱靶(Off-target)效应, 目前的研究并不多。从仅有的几篇报道来看, TALEN的特异性很高, 脱靶效应远远低于ZFN。可通过前述的TALEN靶点预测网站(http://boglabx.plp.iastate.edu/ TALENT/)预测特定基因组中潜在的脱靶位点, 然后通过深度测序检测TALEN的脱靶效应[10]。 3.3 TALE重复序列组装载体的问题
(1)TALE重复序列组装过程中是以pMD18-T载体作为骨架。该载体骨架仅用于承载TALE重复序列, 并不用来表达TALEN蛋白, 因此, TALE重复序列的插入方向并不影响其进行酶切—连接的组装。如果用该载体骨架上的通用引物对TALE重复序列
第4期
沈延等: TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 543 (包括起始载体和中间载体)进行测序验证, 则只要测序结果正确即可, 无论所得到的序列跟预期序列等同还是反向互补, 均可用于后续的组装步骤。
(2)为了尽量降低序列的重复性, 本实验室采用的TALE重复单元中除了RVD之外, 某些其它位点(例如第四位的氨基酸残基)的序列也有可能存在一些差异(例如第四位的氨基酸残基有可能为A、D或E), 但是并不影响使用(图10)。
图10 TALE重复单元中可变的氨基酸残基
(3)本方法(“单元组装法”)在载体构建上有一个独特的优点：载体构建过程中每一轮产生的中间载体(甚至酶切、回收的产物)都可以保留下来, 用于其他TALEN的构建。这样一方面可以避免重复构建中间载体, 另一方面可以节省时间和精力, 提高构建效率。TALEN载体构建得越多, 中间载体就会积累得越多, 这样新TALEN的构建效率也会越来越高。例如, 如果预先构建好全部16个双单元载体, 就可以直接从双单元开始构建TALEN, 而不需要从单载体开始, 这样就可以节省一轮的时间; 如果除了4个单载体之外, 还预先构建好全部的双单元(16个)、三单元(64个)和四单元(256个)载体, 那么只需要两轮就可以构建出16个完整的TALE重复单元, 比从单载体开始可节省一半的时间。 3.4 TALEN组装中的酶切问题
NheⅠ、SpeⅠ和HindⅢ等内切酶也可以选用其他公司的产品。根据我们的经验, 用NheⅠ和HindⅢ双酶切TALE重复序列载体时有时会出现多余的条带(预期应该只有一个条带), 这有可能是NheⅠ或HindⅢ的星活性造成的。如果出现这种情况, 建议改用NEB的HF(high fidelity)酶, 同时减少质粒的用量(例如<1 μg), 酶切时间也不要太长(例如控制在2 h之内)。 3.5 TALEN显微注射的问题
对于新构建的TALEN对, 可尝试注射不同的剂
量的mRNA, 从中选取一个最佳剂量用于制备斑马鱼突变体。一般而言, mRNA的注射量越大, TALEN作用的效率就越高, 不过, 斑马鱼胚胎的畸形率也会随之上升、存活率下降; 每半位点TALEN mRNA的注射剂量超过100 pg后胚胎畸形率的上升会更为明显。根据我们的经验, 剂量范围可控制在50~150 pg/半位点, 一般100 pg左右为最佳剂量, 可兼顾胚胎的存活率和TALEN的效率。在这个剂量下, 斑马鱼胚胎的存活率一般可达到90%以上。
4 结果示例与经验总结
本实验室在原来已发表的文章基础上, 增加了针对最后一位碱基(对应最后的0.5个TALE重复单
元)为A、C和G的FokⅠ载体, 并构建出了所有的三单元TALE载体(64个)和四单元TALE载体(256个), 这样既扩大了靶点的选择范围, 又可以节省载体的构建时间。目前, 本实验室利用单元组装法已成功构建了100多对针对斑马鱼不同基因组位点的TALEN, 经内切酶检测, 突变成功率大于70%(未发表数据), 这与Cade等[19]最近报道的结果类似。本实验室一半以上的TALEN位点的突变效率大于30%, 有的甚至接近100%, 这充分显示了在斑马鱼中应用TALEN技术的高效和简便。其中, 本实验室大部分未检测到活性的TALEN靶点的信息可参考EENdb网站(http://eendb.zfgenetics.org/)[10]。
斑马鱼性成熟一般需要3个月的时间。如果希望加快实验进度, 可以通过增加营养、改善饲养条件来缩短斑马鱼性成熟所需的时间。例如, 鱼的密度要适中, 在正常喂食之外加几次餐, 特别是晚上要加餐。如果饲养得当, 大部分雄鱼出生后两个月即可跟雌鱼杂交产生后代。最快甚至可以做到一个半月的雄鱼就开始用于交配、产生后代。在同等的饲养条件下, 雌鱼所需的性成熟时间要相对长一些。建议优先筛选雄性F0。根据我们的经验, TALEN的效率达到10%以上时, 一般最多筛选10个F0即可获得所需的突变。
打靶成功后, 建议至少保留两个不同的(indel)突变鱼系, 并且最好是造成不同的frame-shift突变, 以便相互印证突变表型。注意根据斑马鱼突变体和等位基因的命名规则为筛选到的鱼系和突变进行正确命名[20,21]。
如果得到了很重要的突变体, 建议考虑
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通过精子冻存的方法进行长期保种[22]。
附 录：补充材料见WWW.Chinagene.cn。
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