基-2-ketopurine (isoG)和2-氨基-4-ketopyrimidine (isoC)间的碱基对，他们分别是G和C的结构异构体(Figure 5)。19Benner团队证实了isoG-isoC对通过克列诺片段在复制中互补作用。此外，isoG基质(isoGTP)并入RNA 相对于isoC 并入DNA 模板，通过T7 RNA聚合酶。21 此外，1992年，isoG-isoC对用于体外翻译系统，通过一个短的化学合成mRNA(含isoC)和一个3-iodotyrosyl tRNA (含isoG) ,使得不标准氨基酸特定合并成为多肽。22
Benner团队这些开创性的研究对利用非自然碱基对的遗传膨胀系数受到了很大的关注。然而，这些非自然碱基对仍有很多的缺点。比如，isoG碱基溶液中经受keto-enol互变异构化，isoG碱基与T烯醇化(Figure 5)。21 除了isoG的问题，isoC中的2-氨基,相当于自然碱基的2-keto位置，降低与聚合酶的相互作用。21此外，isoC的核苷在水溶液中不稳定，室温下，四天以后水中中性环境下会有50% 的isoC核苷三磷酸分解掉。23尽管在isoC碱基位置3处(相当于自然嘧啶碱基位置5处)引入甲基可以改良其稳定性，然而 甲基-isoC 核糖核苷仍然易受其β-糖苷键差向异构化作用，从β-转换为α-形式。最近，Benner团队通过在位置3处引入一个硝基解决了这个问题,24 如下所示。
2005年, Benner团队通过利用一个改性的T 碱基，2-thiothymine (TS),替代T (Figure 5), 解决了isoG keto-烯醇互变异构化的难题，用于isoG-isoC碱基对系统。25 TS中大尺寸的硫原子阻止了isoG形式中与烯醇的配对, 但仍是没有空间斥力的配
对。这个策略类似于Kool的配对碱基键形状适合概念，以及Harry 1988年报道的的非自然碱基对的概念，26 他利用一个改良的鸟嘌呤，6-thioguanine作为一个新的碱基。非自然isoG-isoC对与A-TS对在酶聚合链反应中共同作用：isoG-isoC对的每一次复制选择性达到98%，而isoG-isoC选择性在没有TS的帮助下每次复制达到93%。25然而，98%非自然碱基对选择性对于复制来说是不够的，并且非自然碱基对的保留率在PCR反应扩大DNA 片段的20周期中变为67% (0.9820 =0.67)。因此，对于复制中非自然碱基对的实际使用中，每一次复制超过99% 的选择性是必要的。
2007年，Benner团队改进了非自然碱基对系统，并研发了P-Z 对，其在PCR扩增中不需使用A-TS对(Figure 5)。24 不同于isoG，P碱基在溶液中不经历不良的互变异构化。Z碱基中的硝基基团由于其亚氨基的去质子化，阻止了它的核苷衍生物的差向异构化。虽然P-Z对选择性当时在PCR中为97.5% ，但是最近的报道表明优化PCR 条件下改良的选择性在99.8%。27
5. Romesberg团队的疏水性非自然碱基对
Kool的关于非氢键碱基对的开创性实验引发疏水性碱基对作为非自然碱基对的候选物。Floyd Romesberg和他的同事开发了大量的疏水性非自然碱基对，在复制系统中检测他们的能力。1999年，他们报道了一个疏水性异喹啉衍生物PICS(Figure 6)，其自我互补碱基对在双螺旋DNA 片段中具有很高的热稳定性。28此外，PICS酶作用物与DNA酶结合通过克列诺片段与PICS在模板中相对应。
不幸的是，在PICS 基板中参入PICS后，引物暂停延伸。这是因为PICS-PICS对的形状对于常规DNA双螺旋的空间来说太大了，其PICS 碱基相互堆叠，不允许聚合酶识别。因此，他们详尽的设计和合成了另外的疏水性非自然碱基对，并在复制中检验了它
们的能力。29-35
2009年，他们成功的开发了疏水性非自然碱基对5SCIS-MMO2和5SCIS-NaM (Figure 6)，他们的功能是作PCR扩增中三分之一的碱基对。36, 37与之前的PICS–PICS对相比， 这些碱基对的空间互补形状有所改进。5SCIS–NaM 对在PCR中最佳的保真度达到99.8%，尽管它取决于周围非自然碱基对的排列顺序。这些疏水性碱基对通过T7 RNA 聚合酶在转录中也起作用。38 该团队还通过一个进化工程技术设计出DNA聚合酶，通过采用突变聚合酶了解决复制中使用PICS-PICS 碱基对时聚合酶暂定问题。39
6. Hirao团队的一系列非自然碱基对
我们团队在1997年之后也研究了非自然碱基对。大量的“proof of concept”实验后，我们于201年开发出第一个非自然碱基，在2-氨基-6-dimethylaminopurine (x)和2-oxopyridine (y)之间(Figure 7)。40这个x-y设计包含两个概念：Benner氢键模式(它不同于自然碱基对’s)和一个位阻效应。这个x-y对具有两个氢键，x 的2-aminopurine 部分通过一个类似的氢键作用与T 配对。因此，我们在x的6位置处添加一个巨大的二甲胺基团, 通过T中6-dimethylamino 基团和4-keto基团之间的空间位阻来排除x-T配对。与 T相反, y 具有一个氢键代替了keto 基。x-y 对功能在转录中具有很高的选择性，T7RNA聚合酶混合y三磷酸基质(yTP) 成为RNA,相对于x 在DNA模板中，具有高于95%的选择性。
此外，我们通过用一个噻吩基替代二甲胺基改进了非自然碱基对的形状互补性。因此，我们开发了2-amino-6-thienylpurine (s)作为y的配对搭档 (Figure 7)。41噻吩基的平面化比X二甲胺基更加有效的排除了与T 的错误配对。此外，平面性增加了s 碱基与相邻碱基在DNA 链中叠加的能力。相比x-y 对，s-y对在转录中的选择性和效率都有了很大的改进 不仅仅yTP 也包括yTPs的一些部分，通过T7 RNA聚合酶，比如biotin-和fluorophore-linked y 碱基，与RNA结合,相对应于DNA模板中。42-442002年，通过结合特定的含有s–y对和一个E. coli体外翻译系统的转录，我们成功的特定结合一个非标准氨基酸，3-chlorotyrosine变为一个蛋白质。41 因此，s–y对可疑作为体外翻译和转录系统中第三个碱基 。
我们试图进一步的改进我们这些非自然碱基对。一个主要的障碍是s–y对复制中不足的选择性。PCR的一个DNA含有s–y碱基对片段10个周期过后，大约有40%的非自然碱基对被自然碱基对所替代。每一次复制中s–y对选择性是~95%(40%的替代，10周期PCR过后: 1?0.9510=~0.4)，因此，对于非自然碱基对复制中超出99% 的选择性时必须的，一个非自然碱基对约~90% (0.9910 =~0.90)可保留。因此，我们严格的精炼碱基对之间的形状互补，并设计了一个五元环核苷模型，imidazoline-2-one (z),45 代替六元环y，作为s的配对搭档 (Figure 7)。此外，我们祛除了来自s-z对之间的含有氢键相互作用的原子和残基，46 在7-(2-thienyl)imidazo[4,5- b]-pyridine (Ds)和pyrrole-2-carbaldehyde (Pa)之间开发了一个疏水性非自然碱基对 (Figure 7, 参阅化学合成附录)。47我们在Pa 碱基上添加一个醛基，作为一个质子受体用于聚合酶之间的相互作用。
Ds–Pa对的问题是self-complementary Ds-Ds配对在复制中也有竞争力的发生。也发现了Romesberg’s PICS–PICS对，在Ds合并含有 对立面的Ds时的扩展停顿。幸运的是，我们发现了一个改良过后的Ds三磷酸基质，γ-amidotriphosphate, 选择性的结合opposite Pa，但是结合opposite Ds之后显示出大幅度的减少。47改进过后的基质合并，因为基质的amidopyrophosphate部分被祛除作为一个聚合作用中的离去集团，DNA具有母磷酸二酯键合。为了PCR扩增，我们除了Ds也使用A中的γ –amidotriphosphate，来降低dATP 相对Pa.的插入性错误。2006年，我们使用A中的γ –amidotriphosphate和Ds，成功的完成了含有Ds–Pa对的高选择性PCR扩增，其中每一次复制Ds–Pa对的选择性达到99%以上。一个偶然的失误，我们通过处理三磷酸合成中间体意外的合成了γ -amidotriphosphates，5'-三磷酸酯环状物，具有浓缩氨。
我们进一步的改进了Ds-Pa对，用硝基替代Pa中的醛基，因此设计了2-nitropyrrole (Pn)(Figure 7)。48 Pn的硝基通过硝基中的氧和A中的1-氮之间的静电斥力可以减少A opposite Pa的插入性错误。另外，我们在Pn碱基4-位置处添加丙炔基，开发出 2-硝基-4-propynylpyrrole (Px) 作为Ds的配对搭档(Figure 7)。49 丙炔基增加了疏水性，增强了聚合酶之间的相互作用。因此,Ds-Px对在PCR中的功能不需要γ –amidotriphosphates的援助。含有Ds-Px对的DNA 片段通过PCR 40周期后被放大108-fold，超过97%的Ds–Px对仍被保留在扩大的DNA中。The selectivity of the Ds–Px对的选择性在每次复制中达到99.9%以上，这是迄今为止非自然碱基对中最高的选择性。
